草蓯蓉環烯醚萜苷對肝癌細胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

崔香丹， 鄭 峰， 朱潔波， 全吉淑， 尹學哲*

（1.延邊大學 附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學 醫學院，吉林 延吉 133000）

如今，原發性肝細胞癌（HCC）的新發呈迅猛的增加趨勢[1]，WHO揭曉的《全球癌癥報告》表明，肝癌的新發和死亡人數中國居世界第一[2]。惡性腫瘤的發生與細胞凋亡、增殖緊密相關[3]。細胞凋亡是由基因調控引起的細胞環境和死亡信號變化引起的程序性細胞死亡過程。腫瘤細胞與實體腫瘤中都存在細胞凋亡，且凋亡程度的好壞直接與腫瘤的發展程度相關。

草蓯蓉為中國傳統的民族藥，為我國二類保護植物，是大興安嶺高山地區、長白山特有植物[4]。草蓯蓉環烯醚萜苷（Iridoid glycosides from Boschniakia rossica，IGBR）是草蓯蓉重要活性成分，具有抑制腫瘤、誘導凋亡、抗氧化、保肝等作用[5-6]。目前對IGBR抗癌機制方面的研究受到廣泛的關注。探討二乙基亞硝胺（DEN）誘發大鼠肝癌中IGBR對細胞凋亡及細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的作用，進一步闡明其抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠購自延邊大學實驗動物中心，Bax、Bcl-2多克隆抗體、TUNEL和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋，IGBR為延邊大學基礎醫學院全吉淑教授惠贈。

1.2 肝癌大鼠模型的制備

Wistar雄性大鼠148只，分為對照組、模型組、5-FU組及IGBR組。對照組大鼠第1天給予腹腔注射1次0.1 mL/hg生理鹽水；余3組大鼠第1天腹腔注射1次200 mg/kg DEN，然后給予飲用體積分數0.05%的DEN水溶液。5-FU組大鼠腹腔注射25 mg/kg 5-FU每周3次；IGBR組大鼠灌胃500 mg/kg IGBR每日1次。實驗第12、20周末處死6只動物，第28周末處死24只動物，取心臟血，肝臟福爾馬林固定。

1.3 檢測方法

HE染色觀測肝臟病理變化，TUNEL法檢測肝細胞的凋亡，免疫組化法檢測Bax和Bcl-2的表達。每張切片中陽性細胞率＜5%為陰性（-）；5%～25%為弱陽性（+）；25%～50%為中等強度陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。

1.4 統計學處理

利用SPSS19.0統計軟件，計量資料以X±s表示，計數資料以X2檢驗和Spearman等級相關檢驗表示，P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟組織病理學改變

2.1.1 HE染色 對照組肝小葉結構正常，肝索排列正常。模型組病理變化可分為3個階段。1）肝炎階段（12周）:可見炎性反應、壞死和淋巴細胞浸潤、膠原沉積及凋亡小體。2）肝硬化階段（20周）:可見結節性肝細胞再生，不同大小的肝結節，肝小葉正常結構破壞、肝索排列紊亂。3）肝癌階段（28周）:可見肝細胞核深染，肝細胞變性、增生，部分可見癌細胞增生。5-FU組及IGBR組病理變化較模型組明顯改善，但兩組間無明顯差異。

2.1.2 肝細胞凋亡染色 對照組大鼠肝細胞凋亡稀少，著色淺。與對照組比較，模型組細胞凋亡顯著增加，胞質呈棕黃色，凋亡的肝細胞固縮、核濃縮、核仁消失，差異有統計學意義（X2=11.510，P＜0.01）。與模型組比較，5-FU組與IGBR組凋亡明顯增多，差異有統計學意義 （5-FU組X2=11.147，IGBR組X2=7.813；P＜0.05），但兩組間無顯著差異（X2=2.424，P＞0.05），（見表 1 和圖 1）。

圖1 肝組織TUNEL及Bax、Bcl-2免疫組化觀察結果(×100)Fig.1 Observation of TUNE and Immunohistochemical observation of Bax,Bcl-2of liver sections(×100)

表1 肝細胞凋亡檢測及Bax、Bcl-2在各組大鼠肝組織中的表達情況Table 1 Apoptosis of liver cells and the expression of Bax and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化染色結果

Bax和Bcl-2陽性細胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中，表達于胞漿（見表1，圖1）。與對照組比較，模型組Bax和Bcl-2表達明顯增強（Bax X2=15.607，Bcl-2 X2=6.276；P＜0.05）；與模型組比較，5-FU組和IGBR組Bax表達明顯增強，而Bcl-2表達明顯減弱 （5-FU組Bax X2=9.202，IGBR組Bax X2=7.895；5-FU 組 Bcl-2 X2=7.719，IGBR 組 Bcl-2 X2=6.907；P＜0.05），兩組間無顯著差異（Bax X2=0.956，Bcl-2 X2=2.827；P＞0.05）。

2.3 各組大鼠肝組織Bax與Bcl-2之間的相關性

Bax表達與Bcl-2表達，對照組無相關性（r=-0.090，P＞0.05），模型組呈負相關 （r=-0.302，P＜0.05），5-FU 組呈負相關 （r=-0.844，P＜0.05），IGBR組呈負相關（r=-0.766，P＜0.05）。

3 討 論

DEN誘發的大鼠肝癌多為肝細胞肝癌，造模簡單易成功。研究表明，DEN誘癌整個過程與人類肝細胞癌進程相似[6]。DEN在致癌過程中損傷肝細胞正常結構，使肝細胞代償性增生。隨著給藥時間的延長，DEN在體內的毒性堆積，可啟動癌變機制，肝組織病變程度也逐漸加重，引起大鼠的中毒反應，并導致肝癌的形成。本實驗用DEN誘發大鼠肝癌過程中發現，造模第28周時HE染色結果顯示肝細胞核大、深染、變性、異型增生，可見癌變細胞，成功地誘發了肝癌模型。與模型組相比，IGBR組和5-FU組病理變化均減輕，表明IGBR阻止了DEN的致癌進程，保護了肝組織。

肝癌的發生機制非常復雜，與細胞的增殖和凋亡發生異常相關。細胞凋亡是細胞的程序性死亡，能調控機體發育和內環境穩定[6-7]。研發及評估抗腫瘤藥物的重要指標與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關[8-9]。有大量的研究表明，抗凋亡因子在腫瘤細胞株和實體腫瘤中表達增加，使正常的凋亡程序受到抑制，而增殖能力不斷增強[10]。

細胞凋亡的發生受多種基因的調控，其中Bax和Bcl-2備受關注，且其比值決定細胞接受凋亡信號后存活與否，在調控凋亡中起關鍵作用[11-13]。正常情況下，Bax和Bcl-2的相互調節處于相對穩定的狀態。當誘發癌變時，Bax/Bcl-2表達失衡可加重癌變的進展。大量研究表明，中草藥對細胞的凋亡有不同程度的誘導效果，輔助或協同細胞毒藥物對癌細胞起殺傷作用，其作用機制與凋亡相關蛋白的表達失衡相關[14]。

Bax為凋亡促進蛋白，Bcl-2為凋亡抑制蛋白，細胞中Bax升高則形成Bax同源二聚體，加速凋亡；反之形成Bax/Bcl-2異源二聚體，而抑制凋亡[15-16]。研究報道，肝癌和許多腫瘤細胞凋亡的增加，與Bax/Bcl-2表達失衡有關[17-20]。抑制凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比例高低，反映出細胞凋亡的能力大小[21]。

4 結語

本實驗中除對照組，細胞凋亡均明顯增多。5-FU與IGBR干預后，上調肝癌組織中Bax基因表達，而下調Bcl-2基因表達，并且Bax/Bcl-2比例也隨之升高，表明IGBR可使癌變的細胞發生凋亡，進而抑制肝癌的進展。IGBR可誘發細胞凋亡，抑制肝癌細胞增值，其機制可能與Bax蛋白增多和Bcl-2蛋白減少有關。