耐熱賴氨酸氨肽酶的原核表達及特性表征

黃 浩 ， 周楠迪 ， 田亞平 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

氨肽酶（Aminopeptidases，簡稱 AP）是一類能夠水解多肽N末端附近肽鍵釋放出游離氨基酸的外切蛋白酶[1]。對于蛋白質水解物苦味的去除[2]、提高營養價值以及深加工等方面具有良好的作用，可應用于乳制品、肉制品行業促進食品風味；此外在醫療行業，氨肽酶檢測也可作為一項疾病診斷指標[3]。氨肽酶廣泛存在于動植物和微生物中[4]，根據不同的標準可以分成很多種類。賴氨酸氨肽酶是指切割多肽鏈N末端賴氨酸殘基效率最高的一類氨肽酶[5]，水解釋放出的游離賴氨酸是人和動物的必需氨基酸，對于人體代謝水平的調節、鈣離子的吸收和積累及增強體質等方面具有重要作用[6]。因此，賴氨酸氨肽酶在食品工業領域具有廣泛的應用價值。

耐熱酶是一類能夠在高溫下保持活性的酶，在工業領域具有降低制備成本、提高反應速率、生產工藝簡化等優勢，應用前景廣闊[7-8]。因此自從70年代發現產生耐熱酶的嗜熱菌以來，耐熱酶迅速成為一個重要的研究領域[9]。目前，大多數研究仍集中在耐熱酶產生菌的篩選及分離純化上[10-11]，由于野生嗜熱菌的培養條件嚴格、生長速度較慢，實現耐熱酶在常溫宿主中的表達成為一個新的研究方向。

作者在篩選得到一株耐熱賴氨酸氨肽酶產生菌P.sdfdsafda的基礎上[12]，克隆得到該耐熱酶的編碼基因，構建重組基因并實現了重組酶在原核宿主E.coil中的異源表達，純化得到電泳純的酶液并初步研究了其特性表征，為進一步研究實現耐熱賴氨酸氨肽酶的工業化應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒 Pseudomonas aeruginosa NJ-814:實驗室篩選與保藏；菌株E.coil JM109、E.coil BL21（DE3）:Novagen 公司產品；質粒 pET-42a(+):大連寶生物公司產品。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母粉:英國oxoid公司產品；基因組提取試劑盒:天根生化科技公司產品；質粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、硫酸卡那霉素:上海生工公司產品；限制性內切酶、DNA marker、T4 DNA連接酶:大連寶生物公司產品；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒:碧云天生物技術研究所產品。

1.1.3 培養基 LB液體培養基（g/dL）:1胰蛋白胨，0.5 酵母粉，1NaCl；自然 pH。

TB液體培養基 （g/dL）:1.2胰蛋白胨，2.4酵母粉； 體積分數 0.5%甘油，72mmol/L K2HPO4·3H2O，17mmol/L KH2PO4。

LBK、TBK培養基:分別對應在LB液體培養基、TB液體培養基中添加終質量濃度為50 μg/mL過濾除菌的硫酸卡那霉素（Kan）。

固體培養基即在對應液體培養基基礎上添加1.5 g/dL的瓊脂粉。

1.2 賴氨酸氨肽酶基因的獲取

1.2.1 P.aeruginosa基因組的提取 實驗室前人從土壤中篩選得到一株氨肽酶產生菌銅綠假單胞菌NJ-814（Pseudomonas aeruginosa NJ-814）。取甘油冷凍保藏的P.aeruginosa NJ-814，劃線于LB平板37℃活化培養，挑取活化好的單菌落轉接到LB液體培養基，37℃、220 r/min振蕩過夜培養。取適量培養液，根據細菌基因組DNA提取試劑盒操作方法提取Pseudomonas aeruginosa基因組。

1.2.2 編碼基因的克隆 根據NCBI公布的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GF31氨肽酶基因序列設計引物:lap-s:5'CCGgaattcATGGTCAGCACCC CGCTTGGCCTGCCGC 3'（小寫字母表示EcoRⅠ酶切位點）；lap-a:5'CCGctcgagTTACTTGATGAAGTC GTGACC 3'（小寫字母表示XhoⅠ酶切位點）。利用1.2.1中提取的基因組作為模板，PCR擴增lap基因。 PCR 反應體系（50 μL）:模板 2 μL，lap-s 2 μL，lap-a 2 μL，ddH2O 19 μL，PrimeSTAR MAX 25 μL。PCR反應條件:95℃5 min預變性；95℃15 s變性，55℃30s退火，72℃90s延伸，循環35次；72℃ 5 min后延伸。

1.3 重組菌的構建與表達

1.3.1 基因的連接與轉化 PCR產物通過純化試劑盒純化，與質粒pET-42a（+）用限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ同條件雙酶切，酶切產物經過瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，膠回收產物通過T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接液42℃熱擊轉化E.coil JM109感受態細胞，涂布到LBK平板上37℃過夜培養，篩選出具有Kan抗性的轉化菌株。菌落PCR篩選陽性轉化子，培養后用質粒抽提試劑盒提取重組質粒，雙酶切驗證并送檢上海生工測序。

1.3.2 重組酶的誘導表達與檢測 重組質粒轉化E.coil BL21（DE3）感受態細胞獲得重組菌BLAP。挑取單菌落接種于5 mL LBK液體培養基，37℃、220 r/min振蕩過夜培養，再以1%的接種體積分數轉接到50 mL TBK液體培養基中培養至OD600達到0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導劑IPTG，16℃低溫誘導36h。誘導培養結束后，取發酵液離心得到發酵液上清和菌體沉淀，沉淀用 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.5）緩沖液漂洗后超聲破碎，破碎液離心收集上清液。

通過LNA比色法[13]測定發酵液上清中的胞外氨肽酶酶活和破碎液上清中的胞內氨肽酶酶活。2 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 9.0）緩沖液加入 1 mL底物亮氨酸對硝基苯胺（L-Leu-pNA）和1 mL適量稀釋的上清液，80℃水浴條件反應10 min，405 nm波長下比色測定吸光值。

取發酵液上清和破碎液上清作為實驗組進行SDS-PAGE電泳，以未連接lap的質粒pET-42a(+)轉化E.coil BL21（DE3）后經過同條件處理作為對照組，驗證重組酶的表達情況。

1.4 重組酶的純化與酶學性質

通過Ni-NTA親和層析對重組酶進行純化分離并進行SDS-PAGE電泳驗證。

初步研究了純化后的重組酶的酶學性質。

1.5 酶活定義

在80℃水浴條件下每分鐘分解亮氨酸對硝基苯胺（L-Leu-pNA）產生1 μmol對硝基苯胺所需的酶量，即為1個酶活單位。

2 結果與討論

2.1 重組菌的構建

根據NCBI公布的Pseudomonas aeruginosa GF31氨肽酶DNA序列設計引物，以Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因組為模板，PCR擴增出大小約1.5 kb的DNA條帶。純化的PCR產物與質粒pET-42a（+）經過 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切，成為兩端帶有相同粘性末端的基因片段，在T4 DNA連接酶的作用下部分連接形成重組質粒。重組質粒轉化進入E.coil感受態細胞后能使轉化子在含有卡那霉素的LB平板上長出單菌落，通過菌落PCR進一步將陽性轉化子從空載質粒轉化菌株中篩選出來，能夠擴增出目標條帶的即對應構建成功的重組菌BLAP。

BLAP經過培養提取重組質粒進行雙酶切驗證。重組質粒在上海生工測序后得到lap基因的DNA序列，通過DNAMAN翻譯出其所對應的氨基酸序列，如圖1所示。該基因長度為1 461 bp，與凝膠電泳結果相符，共編碼486個氨基酸，通過分析軟件ExPASy預測其相對分子質量大小約為54×103。將序列提交到NCBI通過Blast比對，確認PCR擴增得到的目的基因為編碼Pseudomonas aeruginosa氨肽酶的DNA。

圖1 lap基因的核酸序列和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of gene lap

2.2 重組酶的表達

BLAP按1.3.2所述條件誘導培養后，測得胞內氨肽酶酶活約2.5 U/mL，胞外未測到氨肽酶酶活。已知重組酶相對分子質量大小約為54×103，同時載體質粒pET-42a(+)上GST標簽能夠表達出約26×103的融合蛋白，共80×103左右，SDS-PAGE對重組酶表達情況的驗證結果見圖2，可以觀察到破碎液上清電泳在66.4×103與97.2×103之間出現一條對照組沒有的條帶，可以證明重組酶的成功表達。

M:蛋白質相對分子質量標準；1:實驗組破碎液上清液；2:對照組破碎液上清液；3:實驗組發酵液上清；4:對照組發酵液上清液

2.3 重組酶的純化

載體質粒pET-42a(+)帶有His-tag，使得表達的重組酶能夠通過鎳柱親和層析進行分離純化，純化結果如表1所示，重組酶純化倍數為4.7倍，回收率為83.5%。純化后的酶液進行SDS-PAGE分析得到電泳純，見圖3。

表1 重組酶鎳柱純化結果Table 1 Ni-NTA purification results of the recombinant

2.4 重組酶的酶學性質

2.4.1 最適反應pH和pH穩定性 室溫條件下配制不同pH（3.0～11.0）的緩沖液，測定重組酶在各緩沖液體系中的酶活，如圖4，以pH值為橫坐標、相對酶活為縱坐標，確定該酶的最適反應pH為8.3；將酶液置于不同pH條件下，30℃水浴保溫1 h后，測定其殘留酶活，由圖5可知該酶在pH 6.5～9.5之間具有較好的穩定性。與課題組報道的野生菌所產氨肽酶最適pH為9.0、在pH 7.5～10.5之間具有穩定性[14]是一致的。

圖3 鎳柱純化后的重組酶SDS-PAGE驗證Fig.3 SDS-PAGE identification of the Ni-NTA purified recombinant enzyme

圖4 重組酶最適反應pH Fig.4 Optimal reaction pH of the recombinant enzyme

圖5 重組酶pH穩定性Fig.5 pH stability of the recombinant enzyme

2.4.2 最適反應溫度和溫度穩定性 將重組酶與底物置于不同溫度條件下反應測定酶活，根據圖6可知80℃為最適反應溫度。將酶液于梯度溫度中分別水浴1 h，再按照標準方法測定處理后的剩余酶活，以4℃酶液保存溫度下的酶活作為對照，如圖7所示，該重組酶經過70℃熱處理1 h能保留60%以上的酶活性，與野生菌所產氨肽酶經過70℃熱處理2 h后保留約70%酶活[12,15]相比，熱穩定性略有降低，但仍比多數常溫酶具有更好的耐熱性。

圖6 重組酶最適反應溫度Fig.6 Optimal reaction temperature of the recombinant enzyme

圖7 重組酶溫度穩定性Fig.7 Temperature stability of the recombinant enzyme

2.4.3 底物特異性、動力學分析

分 別 用 Ala-pNA、Arg-pNA、Ile-pNA、LeupNA、Lys-pNA、Met-pNA、Pro-pNA、Val-pNA 作為底物，考察重組酶的底物特異性，如圖8所示，該酶能夠水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA，對LyspNA的水解能力分別是Arg-pNA的6.6倍、LeupNA的2.4倍。

以不同濃度 （0.2～1.4 mmol/L）的Leu-pNA和Lys-pNA作為底物，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，見圖9-圖10，算得以Leu-pNA為底物的米氏常數Km為15.07 mmol/L、最大反應速率Vmax為12.77 μmol/（L·min）， 以 Lys-pNA 為底物的Km和Vmax分別為 4.86 mmol/L、8.76 μmol/（L·min）。

結果表明該重組酶對Lys-pNA親和性更強，與野生菌所產的酶表現出相似的底物特異性，同屬賴氨酸氨肽酶。

圖8 重組酶底物特異性Fig.8 Substrate specificity of the recombinant enzyme

圖9 Leu-pNA底物的重組酶雙倒數圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot of the recombinant enzyme with Leu-pNA as substrate

圖10 Lys-pNA底物的重組酶雙倒數圖Fig.10 Lineweaver-Burk plot of the recombinant enzyme with Lys-pNA as substrate

3 結 語

論文從野生菌Pseudomonas aeruginosa中克隆出編碼一種氨肽酶的基因lap，利用該基因構建的重組質粒pET-42a-lap轉化到異源宿主E.coil BL21（DE3）中，形成能夠表達重組氨肽酶的工程菌BLAP。重組酶經過Ni-NTA分離純化后得到氨肽酶純酶液。對重組酶的酶學性質研究發現，該酶和野生菌所產酶一樣都屬于賴氨酸氨肽酶，在堿性條件下表現出活性，并且具有良好的熱穩定性。為進一步研究該重組酶的高效分泌表達和熱穩定性氨肽酶的構效及進一步的應用奠定了基礎。