茯苓菌固態(tài)發(fā)酵小麥基質(zhì)的成分變化

李佳歡 ， 林 輝 ， 金文松 ， 張燎原 ， 胡開輝 *

（1.福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學（古田）菌業(yè)研究院，福建 寧德352200）

茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）作為一種藥用真菌，目前已報道的生物活性物質(zhì)包括多糖類、甾體類、蛋白質(zhì)、四環(huán)三萜類、三環(huán)二萜類等[1-3]。現(xiàn)代藥學研究證實，茯苓具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫功能等多種生物活性[4-6]。現(xiàn)階段，人們對茯苓的利用不僅局限于子實體，還可以通過其菌絲體進行液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵，提取其發(fā)酵產(chǎn)物。

谷物因具有豐富的營養(yǎng)成分，如淀粉、蛋白質(zhì)、植物脂肪、微量元素等，可供給微生物生長所需的營養(yǎng)成分，是很好的發(fā)酵基質(zhì)。營養(yǎng)學分析表明，谷物在經(jīng)發(fā)酵后，其營養(yǎng)成分將會更加豐富。文獻[7]的研究表明，經(jīng)自然發(fā)酵后的豇豆等豆科植物，其賴氨酸、蘇氨酸等必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)明顯提升。文獻[8]的研究中指出，燕麥、大豆2種混合谷物經(jīng)灰樹花孔菌進行固態(tài)發(fā)酵后，其總?cè)啤⒖偠喾拥瓤寡趸钚猿煞志兴嵘宄杂苫芰︼@著增強。文獻[9]對桑黃發(fā)酵的薏米、稻米展開研究，發(fā)現(xiàn)兩種谷物經(jīng)發(fā)酵后，其抗氧化能力明顯增強。

在微生物的作用下，谷物的營養(yǎng)組成發(fā)生了變化，同時發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，一定程度上提升了谷物的附加值。但在已有的研究中鮮見以茯苓菌為菌種對谷物進行發(fā)酵的報道，更未有研究對發(fā)酵過程中的酶活及各有效物質(zhì)的變化展開研究。本研究采用無毒保健的茯苓菌對小麥進行發(fā)酵，初步分析了發(fā)酵過程中茯苓菌關鍵酶活性質(zhì)的變化，并探討了酶活變化與產(chǎn)物營養(yǎng)成分變化之間的關系，以期為茯苓發(fā)酵口服液、飲料等功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

小麥購自福州農(nóng)貿(mào)市場；茯苓菌種由福建農(nóng)林大學微生物工程實驗室提供；葡萄糖購自Sigma試劑公司；其他試劑皆為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

Agilent1100高效液相色譜儀，美國 Agilent公司產(chǎn)品；BS110S型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠制造；DHG-9203型鼓風干燥機，上海精宏公司產(chǎn)品；LRH-250型恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠制造；UV1100型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；5804R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PB10型pH計，德國賽多利斯集團產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基 PDA加富固體培養(yǎng)基:土豆（去皮）200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨3 g、酵母提取粉 3 g、硫酸鎂 1.5 g、磷酸二氫鉀 1.5 g、維生素 B10.1 g、瓊脂 20 g，加水定容至1 000 mL，pH自然，115℃滅菌30 min。

小麥固體培養(yǎng)基:去除小麥中雜質(zhì)與空心小麥顆粒，用蒸餾水沖洗2~3次，去除灰塵、麥麩等雜質(zhì)，加蒸餾水至剛好浸沒小麥，于40℃水浴2 h，將小麥撈出，按料液比1∶1.2加入蒸餾水煮至小麥飽滿全熟無白心，注意小麥不能裂開，以避免營養(yǎng)散失。將煮好的小麥粒分裝于栽培瓶中，每瓶110 g，壓平，封口膜封口后121℃滅菌120 min。

1.3.2 發(fā)酵與樣品收集 將滅菌后的小麥固體培養(yǎng)基冷卻至室溫，取活化好的茯苓菌種按5 mL/hg的接種量接至小麥栽培料，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后每隔5 d取1次樣，將所得樣品混勻后置于60℃鼓風干燥機中干燥48 h。將干燥后的發(fā)酵小麥經(jīng)中草藥粉碎機粉碎后，過60目篩，于干燥封閉環(huán)境下保存以供后續(xù)營養(yǎng)成分測定實驗。未接種的小麥經(jīng)過上述處理后作為對照，所有實驗設定3組平行。

1.3.3 提取液的制備 將發(fā)酵小麥取出攪拌均勻后，稱取10 g于研缽中，研磨后移至100 mL三角瓶中，加入50 mL雙蒸水，于150 r/min，25℃恒溫振蕩搖床培養(yǎng)90 min，經(jīng)紗布過濾后，8 000 r/min離心15 min，取上清液即為提取液，用于相關酶活、草酸和pH值的測定。

1.4 測定方法

1.4.1 酶活力的測定方法 淀粉酶活力測定在文獻[10]的方法上進行改良，采用淀粉-碘化鉀顯色法。定義60℃、pH 6.0條件下，1 min液化1 μg可溶性淀粉所需酶量為1個酶活力單位“U”。

木聚糖酶活力測定方法在文獻[11]等方法上進行改良，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。定義50℃、pH=5.2條件下，1 min生成 1 μg D-木糖所需酶量為1個酶活力單位“U”。

羧甲基纖維素酶的測定方法在文獻[12]的方法上進行改良，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。定義50 ℃、pH 4.6的條件下，1 min生成 1 μg葡萄糖（GLU）所需酶量為1個酶活力單位“U”。

1.4.2 茯苓菌發(fā)酵小麥營養(yǎng)成分變化

1）pH值測定:用pH計對樣品粗酶提取液進行測定。

2）草酸測定方法:本研究采用HPLC法來測定小麥中草酸的質(zhì)量分數(shù)。取粗酶液0.4 mL，加入0.2 mL酸性乙醇，在振蕩器上混合1 min，8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。色譜分離柱:SB-Aq C18柱；流動相:0.025 mol/L磷酸二氫鉀和四丁基氫氧化銨溶液（磷酸調(diào)pH2.0）；紫外檢測波長:220 nm；進樣量 2 μL；流動相速度:流速 0.6 mL/min；柱溫30℃。以草酸標品質(zhì)量濃度（mg/mL）為X軸與峰面積的值（Y軸）繪制標準曲線。所得標曲的線性回歸方程為Y=3 039.1X+5.096，R2=0.997 7。

3）總糖測定:參考文獻[13]的方法測定小麥當中的總糖質(zhì)量分數(shù)，采用葡萄糖溶液進行標準曲線的測定，根據(jù)葡萄糖質(zhì)量（X軸）與OD值（Y軸）繪制標準曲線。所得標準曲線的線性回歸方程為:

4）還原糖質(zhì)量分數(shù)測定:參考文獻[14-15]的方法測定小麥當中的還原糖質(zhì)量分數(shù)，采用DNS法進行還原糖測定。以葡萄糖溶液進行標準曲線的測定，根據(jù)葡萄糖質(zhì)量（X軸）與OD值（Y軸）繪制標準曲線。所得標準曲線的線性回歸方程為:

5）多糖測定:參考文獻[16]的方法提取小麥粉中多糖，用苯酚硫酸法測定其吸光值，將結果代入葡萄糖標準曲線計算其多糖質(zhì)量分數(shù)。

6）總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)測定:參考文獻[17]的方法對小麥中的總?cè)疲捎孟悴萑?冰醋酸測定樣品中三萜質(zhì)量分數(shù)。以熊果酸作為標品進行標準曲線的測定，根據(jù)熊果酸質(zhì)量（X軸）與OD值（Y軸）繪制標準曲線，所得標準曲線的線性回歸方程為:

7）水溶性三萜酸測定:取10 g栽培料至三角瓶，加入50 mL的雙蒸水，60℃水浴2 h，每隔半小時搖晃混勻，8 000 r/min離心15 min，取上清液2 mL于烘干箱60℃烘干，烘干后用1 mL雙蒸水溶解，添加 1 mL乙酸乙酯（質(zhì)量分數(shù)99.5%）進行萃取2遍；合并上層液烘干后使用香草醛-冰醋酸測定樣品中三萜酸質(zhì)量分數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用EXCEL軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 茯苓發(fā)酵小麥過程中菌絲生長變化情況

圖1表示的是不同培養(yǎng)時間下，茯苓菌在小麥培養(yǎng)基上的長勢情況，可以看出茯苓菌絲呈白色，菌絲較為纖細，生長速度快，培養(yǎng)6 d即可滿瓶。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲密度逐漸升高且呈白色，充斥麥粒之間的間隙，培養(yǎng)至30 d后菌絲密度不再發(fā)生明顯變化。

圖1 茯苓栽培過程的生長情況Fig.1 Growth of the P.cocos

2.2 茯苓固態(tài)發(fā)酵過程中酶活力變化情況

茯苓栽培過程中纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶的活力變化如圖2所示。

圖2 茯苓固態(tài)發(fā)酵過程纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶活力Fig.2 Activity variation of cellulose，xylanase and amylase produced by P.cocos during the process of solid-state fermentation

小麥基質(zhì)中含有大量的淀粉、纖維素、木聚糖等，這些物質(zhì)可以在相關酶的作用下，分解成單糖以供食用菌的生長所需。通過分析發(fā)酵過程中相關酶活力的變化，觀察茯苓菌的生長情況及其對小麥培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的利用情況。

淀粉為小麥中主要貯藏物質(zhì)，質(zhì)量分數(shù)約為53%~70%。在茯苓菌發(fā)酵小麥的過程中，淀粉酶的活力對菌絲生長起著重要作用。由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的增加，淀粉酶活力不斷增強，在20 d時活力達最大值247.1 U/mL，隨后基本維持在240 U/mL左右，持續(xù)降解淀粉以供茯苓菌絲生長所需。其可能原因為小麥中的淀粉質(zhì)量分數(shù)一直較高，故淀粉酶作為茯苓菌分泌的一種誘導酶，其活力將保持著相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

纖維素是麥麩中的主要成分之一，其質(zhì)量分數(shù)約占其干物質(zhì)的35%～40%[18]。茯苓菌若要利用小麥胚乳中的營養(yǎng)成分，首先要具有降解麩皮中纖維素的能力，因此茯苓菌纖維素酶是茯苓菌能否在小麥基質(zhì)中生長的關鍵酶之一。從圖2可以看出，酶的活力在培養(yǎng)10 d時為100 U/mL，隨茯苓菌發(fā)酵時間的延長，纖維素酶活力以每隔10 d 500 U/mL的速度提升，培養(yǎng)30 d時纖維素酶活達1 150 U/mL，后酶活提升趨勢減緩，40 d時其活力為1 250 U/mL左右。說明茯苓菌可以很好的降解小麥胚乳中的纖維素，以供菌絲生長和代謝所需。

小麥中可溶性多糖（非淀粉）的質(zhì)量分數(shù)可達6%以上，而其主要成分為阿拉伯木聚糖，是機體無法消化利用的成分之一，因此將降低其能量的利用效率[19]，而茯苓菌分泌的木聚糖酶可降解小麥中的木聚糖。由圖2可知，木聚糖酶活力在10～20 d時顯著提高，由54 U/mL提升至1 080 U/mL，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，木聚糖酶活力逐漸降低，在40 d時酶活力為920 U/mL。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物總糖、還原糖及多糖的變化

由圖3可知，小麥發(fā)酵前總糖質(zhì)量分數(shù)高達80%以上，但經(jīng)茯苓菌發(fā)酵后，小麥中的總糖質(zhì)量分數(shù)逐漸降低。培養(yǎng)前10 d總糖降低速度較慢，但10～20 d期間，總糖被迅速消耗，20 d時栽培料中的總糖質(zhì)量分數(shù)僅剩57.2%，隨后總糖下降速率減緩。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，總糖的變化與纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶的變化趨勢呈現(xiàn)顯著的負相關性（r值分別為-0.961、-0.925和-0.958）， 結合發(fā)酵過程中的酶活力變化可知，培養(yǎng)前10 d，由于茯苓菌菌絲酶活力較弱，對營養(yǎng)的利用率較低，總糖降低速率較低。發(fā)酵10～20 d期間，茯苓菌的代謝較旺盛，生長速度加快，淀粉酶、羧甲基纖維素酶及木聚糖酶的活力在該階段的活力大幅提升（P＜0.01）。在3種酶的作用下，小麥中的淀粉、纖維素及木聚糖被大量消耗，總糖質(zhì)量分數(shù)下降速度加快，第20天時產(chǎn)物中的總糖質(zhì)量分數(shù)下降了43.6%。

圖3 茯苓固態(tài)發(fā)酵過程總糖、還原糖、多糖質(zhì)量分數(shù)變化Fig.3 Changesoftotalsugar、reducing sugar and polysaccharidecontents during the solid-state fermentation of P.cocos

茯苓菌在發(fā)酵小麥的過程中，不能直接利用基質(zhì)中的淀粉、纖維素等物質(zhì)，而需要通過相應酶系的作用，將其降解為還原糖后再進行利用，所以還原糖質(zhì)量分數(shù)的變化可以在一定程度上反映真菌對碳水化合物的有效利用率[20]。未發(fā)酵小麥的還原糖質(zhì)量分數(shù)僅為0.389%，發(fā)酵過程中小麥還原糖質(zhì)量分數(shù)呈整體上升趨勢，發(fā)酵35 d時的還原糖質(zhì)量分數(shù)高達27.40%，為未發(fā)酵小麥的70倍。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，總糖的變化與纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶的變化趨勢呈現(xiàn)正相關性 （r值分別為0.986、0.734 和 0.804）。 發(fā)酵 0～35 d 期間，發(fā)酵產(chǎn)物中的還原糖質(zhì)量分數(shù)不斷上升，可能是由于在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶等多酶體系的作用下，碳水化合物轉(zhuǎn)化為還原糖以供菌絲生長利用，而在35 d之后，還原糖質(zhì)量分數(shù)明顯下降，提示茯苓菌菌絲對淀粉、纖維素等碳水化合物的利用率降低。

茯苓發(fā)酵小麥多糖的質(zhì)量分數(shù)在培養(yǎng)0～20 d內(nèi)大幅上升，由8.72%上升至26.83%。多糖質(zhì)量分數(shù)在培養(yǎng)20 d后開始下降，至40 d時下降為14.96%。可能是因為發(fā)酵前期，在相關酶系的作用下，小麥基質(zhì)中的碳水化合物被降解為單糖、還原糖和多糖，茯苓菌首先利用單糖和還原糖，多糖積累下來，其質(zhì)量分數(shù)逐漸提升。隨著茯苓菌代謝逐漸旺盛，其他糖類不能供給茯苓菌絲的正常生長，茯苓菌開始降解小麥基質(zhì)中的多糖供能。多糖的變化情況其與淀粉酶之間存在著一定的正相關性（r=-0.468）。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物pH值及草酸的變化情況

由圖4可知，茯苓菌發(fā)酵小麥的pH值隨培養(yǎng)時間增加而呈下降趨勢，后期趨于平緩。發(fā)酵前期，茯苓菌生長進入對數(shù)期，由于其生長速度快，在利用小麥淀粉為碳源生長時，產(chǎn)生了大量草酸、月桂酸、茯苓酸等有機酸，pH顯著下降，在15 d左右pH值降至3.70左右后逐漸趨于平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期，此時茯苓菌生物量基本保持穩(wěn)定，有利于產(chǎn)物的合成。而隨著培養(yǎng)時間的延長，草酸質(zhì)量分數(shù)有所提高，但在培養(yǎng)的25 d內(nèi)草酸質(zhì)量分數(shù)變化不大，質(zhì)量分數(shù)維持在1.2 g/kg左右，而培養(yǎng)25 d以后，產(chǎn)物中的草酸質(zhì)量分數(shù)迅速提高。

圖4 茯苓固態(tài)發(fā)酵過程pH值及草酸質(zhì)量分數(shù)變化Fig.4 Changes of pH and oxalic acid during the process of solid-state fermentation of P.cocos

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物三萜質(zhì)量分數(shù)的變化

三萜是萜類物質(zhì)中的一種，是真菌和植物在生長過程中產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物。具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、醛固酮拮抗等功效，是一種極具潛力的功能性物質(zhì)[21]。然而僅通過日常飲食攝入，無法滿足人體對三萜的需求。因此，通過食用菌對谷物發(fā)酵，既改良了谷物原本的營養(yǎng)結構，同時可制成富含三萜類物質(zhì)的功能性食品。由圖5可知，發(fā)酵過程中總?cè)婆c水溶性三萜酸變化趨勢相同，隨著培養(yǎng)時間的延長，總?cè)婆c水溶性三萜酸質(zhì)量分數(shù)逐漸提高，在培養(yǎng)至25 d時達到最高值，分別為1.6 g/kg與0.13 g/kg，但隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，兩者的質(zhì)量分數(shù)略有降低。研究指出，茯苓子實體、菌絲體三萜類化合物種類并無差異，只是其質(zhì)量分數(shù)有所不同。本研究得到的茯苓發(fā)酵小麥，采用全麥小麥培養(yǎng)基，通過茯苓菌進行發(fā)酵，其菌絲的生長極大地提升了小麥中的三萜物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，因此，可以以茯苓發(fā)酵后小麥為原料，開發(fā)富含三萜類物質(zhì)的功能性食品。

圖5 茯苓固態(tài)發(fā)酵過程三萜質(zhì)量分數(shù)變化Fig.5 Changes oftriterpenes contents during the process of the solid-state fermentation of P.cocos

2.6 討論

茯苓菌作為一種木腐菌，在生長過程中可以分泌多種酶，將大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解為可供其利用的小分子物質(zhì)。研究菌絲生長過程中的關鍵酶的活性，可以反映出菌絲的生長發(fā)育情況及其對基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化率[22]。本文對茯苓菌發(fā)酵小麥的過程中的酶活分析結果表明，纖維素酶活力隨培養(yǎng)時間延長不斷上升，40 d時達1 280.5 U/mL，這與文獻[23]在研究茯苓菌發(fā)酵木屑培養(yǎng)基中纖維素酶的變化趨勢不同，其原因可能是所采用的發(fā)酵基質(zhì)不同；文獻[24]對杏鮑菇固態(tài)發(fā)酵過程中木聚糖酶的變化情況的研究與本研究所得結果一致，在茯苓菌發(fā)酵小麥的過程中，木聚糖酶活力在20 d時達最大值，為1 073.2 U/mL，隨后略有下降，可能原因是發(fā)酵后期，小麥中木聚糖質(zhì)量分數(shù)下降，導致其酶活力逐漸降低；淀粉酶活力在發(fā)酵20 d時達最高值，約為494.2 U/mL，隨后基本保持穩(wěn)定，這一結果與文獻[25]對銀耳與香灰菌混合培養(yǎng)過程中的變化趨勢一致。由于小麥胚乳中含有大量淀粉，淀粉酶可能作為一種誘導酶存在，在淀粉量維持穩(wěn)定時，其酶活性變化不大。

3 結 語

茯苓菌固態(tài)發(fā)酵的過程中，發(fā)酵產(chǎn)物中的總糖、還原糖、多糖、三萜類物質(zhì)等質(zhì)量分數(shù)都有明顯變化。與未經(jīng)發(fā)酵的小麥相比，茯苓菌發(fā)酵小麥中的總糖質(zhì)量分數(shù)明顯下降，減少了53%；還原糖質(zhì)量分數(shù)顯著上升，由發(fā)酵初期的0.389%上升至27.40%；多糖質(zhì)量分數(shù)由8.72%上升至14.96%，發(fā)酵過程中最高可達26.83%；總?cè)婆c水溶性三萜的質(zhì)量分數(shù)逐漸提高，在培養(yǎng)至第25天時達到最高值，分別高達1.6 g/kg與0.13 g/kg。

通過對茯苓菌發(fā)酵小麥過程中茯苓菌酶活變化和基質(zhì)中營養(yǎng)成份變化的分析，可以看出茯苓菌在發(fā)酵的過程中，通過纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶等酶系的共同作用可將大分子物質(zhì)降解，改善小麥原有的營養(yǎng)結構。由于固態(tài)發(fā)酵方式工藝簡單、原料成本低，又因小麥本身的可食性，在進行后期加工時不需采取將菌絲分離的步驟，極大地簡化了加工流程。綜上所述，可將固態(tài)發(fā)酵技術與傳統(tǒng)谷物加工結合，開發(fā)具有高營養(yǎng)價值的谷物產(chǎn)品，既能促進傳統(tǒng)谷物的應用，又提升了其營養(yǎng)價值，其市場價值可期。