增強馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質熱穩定膠體篩選研究

鄭惠娜 ， 張 凱 ， 周春霞 ， 曹文紅 ， 高加龍 ， 鄭周彬 ，魏 薇 ， 秦小明 ， 章超樺

（1.廣州海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學 廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學 國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

食品加工過程中，熱處理是引起食品成分發生變性，導致食品物理化學特性發生改變的重要原因。動物肌肉加工過程中，蛋白質是最易受熱而發生變性的成分，并且相比于植物蛋白和陸地動物蛋白，水產肌肉蛋白更為不穩定，更易受熱而發生變性，大量研究顯示，肌肉蛋白經過熱處理后其分子結構、物理化學特性等均會在加熱和受熱過程中發生明顯的變化[1-6]。因此，在食品加工過程中，為了防止蛋白質因各種加工因素的影響，常常添加一些親水性膠體，這些膠體能與食品中的蛋白質相互作用，從而穩定蛋白質分子結構，質地和物理化學性質[7-11]。我國水產加工技術相對落后，特別是基礎研究起步較晚，水產資源及其副產品的加工利用率一直處于較低水平，導致長期以來我國水產加工產品單一，高值化加工產品較少。因此，加強基礎性研究，提升水產高值化加工技術水平，對于充分開發和利用我國豐富的水產及副產品資源十分必要。作者以珍珠產業副產物馬氏珠母貝肉為研究對象，在前期研究結果基礎上[12]，篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩定性親水膠體，并分析不同熱處理條件下最佳親水膠體分子對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質熱穩定性的影響，研究結果為進一步開發利用馬氏珠母貝肉以及改善水產肌肉蛋白熱穩定性，提高水產資源及副產品加工利用率、充分開發利用我國水產資源提供理論基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝:購于湛江雷州市珍珠養殖場。

1.2 試劑與儀器

考馬斯亮藍試劑盒:購于南京建成生物工程研究所；福林酚試劑盒，十二烷基苯磺酸鈉（SDS），三羥甲基氨基甲烷（Tris），溴酚藍，R-250考馬斯亮藍:購于北京鼎國生物技術有限公司；丙烯酰胺（Acr-Bis），過硫酸銨，四甲基乙二胺（TEMED），電泳上層膠緩沖液，電泳下層膠緩沖液:購于碧云天生物技術有限公司；卡拉膠，果膠，瓜爾膠:購于美國Sigma公司，其余試劑均為分析純。

JA2003電子天平:上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；JYL-F20絞肉機:九陽股份有限公司產品；T-18高速勻漿機:德國IKA公司產品；J-26S XP高速臺式冷凍離心機:美國貝克曼庫爾特公司產品；DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠制造；DYCZ-24DN雙垂直電泳槽:北京六一儀器廠制造；PHS-3C數顯pH酸度計:上海儀電科學儀器股份有限公司產品；UV-2550紫外可見分光光度計:日本島津公司產品；DK-8D三孔三溫水浴鍋:常州諾基儀器有限公司產品；Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像系統:美國Bio-Rad公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理 馬氏珠母貝肉去殼，去內臟取閉殼肌，清洗瀝干，每袋500 g分裝，置于-40℃凍藏備用。

1.3.2 水溶性蛋白質的提取 水溶性蛋白質提取參考文獻[12]略加修訂，取凍藏馬氏珠母貝肌肉于4℃下解凍16 h，稱取一定量貝肉絞肉機絞碎后，按照1 g∶4 mL比例加入超純水（4℃ 預冷），高速分散機勻漿3 min（冰浴條件下），然后10 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液為粗提馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質。進一步按照50 g/dL比例加入硫酸銨，并于4℃靜置過夜后 10 000 r/min，4℃離心15 min，取沉淀，4℃下透析脫鹽直至采用BaCl2檢測無沉淀，既得馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質（WSP），進一步冷凍干燥后獲得粉末狀水溶性蛋白質（F-D WSP）。

1.3.3 蛋白質濃度測定 樣品蛋白質濃度采用福林酚試劑盒進行測定。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線為:y=0.001 3x+0.001 3，R2=0.998，y為吸光值，x則為樣品濃度。

1.3.4 有效親水膠體的篩選 選取卡拉膠、果膠、瓜爾膠3種親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將水溶性蛋白質WSP配成1 mg/mL的蛋白質溶液。同時，將3種親水膠體配成1 mg/mL的膠體溶液，然后將蛋白質溶液與膠體溶液以體積比10∶1的比例混合均勻，將10 mL混合液及蛋白溶液分裝于玻璃試管中，在 60、70、80、90、100 ℃ 溫度條件下分別水浴熱處理30 min，無添加膠體的蛋白質溶液也在同樣熱處理條件進行處理，樣品經過熱處理后迅速冷卻至室溫，并于600 nm波長下測定熱處理后蛋白質溶液及蛋白質膠體混合溶液吸光值A及A′，樣品的濁度以透光率T和T′表示。通過比較在同一熱處理溫度和加熱時間條件下，蛋白質溶液濁度與蛋白質膠體混合溶液濁度差異（透光率差值ΔT），篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩定性親水膠體。根據下式計算ΔT%:

其中:A為熱處理后水溶性蛋白質溶液吸光值；A′為熱處理后水溶性蛋白質膠體混合溶液吸光值；T為熱處理后水溶性蛋白質溶液透光率；T′為熱處理后水溶性蛋白質膠體混合溶液透光率。

1.3.5 有效親水膠體-蛋白質混合體系熱處理 根據1.3.4篩選出最佳提高水溶性蛋白質熱穩定性親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將WSP配成1 mg/mL（福林酚法定量）的蛋白質溶液，D-F WSP溶解后先4 000 r/min離心5 min取上清液，福林酚法定量配成1 mg/mL蛋白質溶液。根據1.3.4程序進行熱處理，同時比較同樣熱處理條件下最佳親水膠體對WSP和D-F WSP蛋白質溶液熱穩定性的影響差異。

1.3.6 SDS-PAGE分析 將水溶性蛋白質（WSP和F-D WSP）配成質量濃度為2 mg/mL的蛋白質溶液，按照樣品溶液:加樣緩沖液體積比例5∶1混合均勻后，水浴煮沸5 min。采用濃縮膠5 g/dL，分離膠12 g/dL進行SDS-PAGE電泳分離，先恒壓80 V分離30min后改為恒壓160 V分離直至條帶前沿電泳至接近分離膠底部處，關閉電源，小心取下凝膠，切除濃縮膠部分，采用考馬斯亮藍染色均勻后，脫色液脫色直至凝膠底色透明，出現清晰條帶，于Bio-Rad凝膠成像系統中成像分析。

1.3.7 數據分析與處理 實驗數據采用GraphPad Prism5.0（GraphPad Software，Inc.La Jolla，CA USA）和 SPSS 22.0（IBM Inc.，NY，USA）進行作圖分析，數據表示為平均值±SD（n=3），多組數據之間采用單因素ANOVA進行顯著性差異（P＜0.05）分析，兩組數據之間采用獨立樣本T檢驗進行顯著性差異（P＜0.05）分析。

2 結果與討論

2.1 有效親水膠體的篩選

肌肉蛋白可以根據溶解度的差異分為水溶性蛋白（又稱肌漿蛋白）、鹽溶性蛋白（又稱肌原纖維蛋白，主要是肌球蛋白、肌動蛋白和肌動球蛋白）和不溶性蛋白（又稱肌質蛋白）[13]。前期研究結果顯示相對于鹽溶性蛋白，馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的熱穩定性較差[12]。

目前，親水膠體廣泛用于各種食品的加工過程中，其能夠通過增強食品組分凝膠特性、粘稠性、持水性等提高食品的加工特性?？ɡz、果膠及瓜爾膠是食品工業中常用的膠體種類，并且研究顯示這3種膠體對蛋白穩定性起到一定作用[14-15]。作者通過測定不同溫度條件下3種膠體對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質WSP的熱穩定性的差異，篩選出最佳穩定WSP的膠體種類，研究結果（見圖1）顯示:同一熱處理溫度條件下，3種膠體對WSP的熱穩定性的影響存在明顯差異（P＜0.05），并且在熱處理溫度范圍內（60～100℃），卡拉膠對于穩定WSP的效果最好，添加卡拉膠能夠顯著降低WSP溶液在熱處理條件下的濁度值，提高WSP溶液的透光率。而效果相對較差的是果膠，瓜爾膠的穩定效果最差。并且從圖中結果可以看出，隨著熱處理溫度的提高，ΔT逐漸增大，而這種趨勢在果膠及瓜爾膠數據結果中不明顯。蛋白質的熱變性反應十分復雜，隨著熱處理的條件及溫度不同會發生許多結構變化，特別是各種熱處理條件對蛋白質變性過程肽鏈的展開及蛋白質凝聚反應的強度不同，當蛋白質在水溶液中發生熱變性時候，首先肽鏈展開后相互凝聚，蛋白質溶液濁度提高，透光率減少，當變性到一定程度時候，凝聚蛋白質完全變性并在重力作用下發生沉淀，從而使溶解度下降[16-17]。研究結果顯示，在熱處理條件下，卡拉膠作為穩定馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白WSP的效果最好。

圖1 不同溫度條件下3種親水膠體對水溶性蛋白WSP熱穩定性的影響Fig.1 Effect of three colloids on thermal stability of WSP at different

2.2 卡拉膠對水溶性蛋白熱穩定性的影響

2.2.1 WSP與F-D WSP蛋白質溶液組成差異比較貝肌肉水溶性蛋白質主要含有肌漿蛋白、球蛋白和肌白蛋白，大多數的水溶性蛋白質相對分子質量在1～10萬范圍內，分子形狀近似球形[18-19]。研究過程中發現冷凍干燥后的水溶性蛋白質F-D WSP的溶解性較差，難以完全溶解，因此，WSP與F-D WSP可溶蛋白質溶液組成是否有所不同需要進行分析。圖2比較了WSP和F-D WSP蛋白質溶液的蛋白組成差異，從圖中結果分析:未經過冷凍干燥的水溶性蛋白質WSP條帶數較冷凍干燥的水溶性蛋白質F-D WSP多，經過冷凍干燥，能夠溶解于緩沖溶液中的F-D WSP蛋白質條帶主要分布在 9.9×104、6.5×104、4.2×104、3.6×104以及 1.8×104附近。 而未經過冷凍干燥的WSP水溶液蛋白條帶較多，并且與F-D WSP相比較，主要體現在 1.5×105及 8.0×104附近的相對分子質量較大蛋白質，這可能是由于冷凍干燥過程中相對分子質量較大蛋白更容易發生冷凍變性從而溶解性大大降低，以至于冷凍干燥后在緩沖溶液中無法溶解。

圖2 WSP與F-D WSP蛋白溶液組成差異比較Fig.2 Comparison of the protein compositions between WSP and F-D WSP solution

圖3 60℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性影響Fig.3 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 60℃

2.2.2 卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性的影響為進一步研究卡拉膠對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的影響作用，作者同時比較了卡拉膠對未經過冷凍干燥的水溶性蛋白質WSP及冷凍干燥后的水溶性蛋白F-D WSP熱穩定性影響作用的差異性，研究結果見圖3-圖7，從圖3及圖4結果分析，在60℃和70℃熱處理條件下及熱處理時間范圍內 （5～30 min）卡拉膠對F-D WSP和WSP的熱穩定性作用存在明顯差異，在同一處理時間條件下，卡拉膠對F-D WSP的穩定作用明顯優于對WSP的穩定作用，這可能是冷凍干燥后，水溶性蛋白質本身已經發生了一定的變性，親水性較差，溶解于水溶液中再經過熱處理更容易發生凝聚，從而更不穩定，這使得卡拉膠的穩定作用尤為明顯，未經過冷凍干燥處理的WSP蛋白質在60℃及70℃條件下相對穩定性較好。圖5結果顯示了80℃條件下，卡拉膠對WSP的穩定作用開始增強，而對F-D WSP的穩定作用有所減弱，并且隨著熱處理溫度的提高，卡拉膠對WSP的穩定作用開始優于對F-D WSP的穩定作用。這可能是由于在較高溫條件下，經過冷凍干燥處理的F-D WSP易于發生進一步變性凝聚，此時卡拉膠的穩定作用已經不能較為有效抑制FD WSP熱變性進程?？ɡz是一類多糖類物質，各種類型的卡拉膠結構中均含有大量的羥基。Fuente等研究顯示在卡拉膠存在條件下，質量分數2%的乳清蛋白溶液在pH7.0溶液中進行熱處理，乳清蛋白不會失去其天然結構，但是會引起加熱過程中所形成的可溶性聚集物相對分子質量降低[20]。Kelly等研究也顯示，卡拉膠的存在不影響在75℃時加熱的乳清蛋白的聚集，然而，在較高溫度下，卡拉膠的存在對乳清分離蛋白的聚集產生較大影響[21]。蛋白質種類及存在的狀態不同，卡拉膠與其相互作用的機制也不同，整體分析，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對未經過冷凍干燥處理的WSP穩定性作用逐漸增強，而對經過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩定性作用則呈先增強后減弱的趨勢。

圖4 70℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性影響Fig.4 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 70℃

圖5 80℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性影響Fig.5 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 80℃

圖6 90℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性影響Fig.6 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 90℃

圖7 100℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩定性影響Fig.7 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 100℃

3 結 語

親水膠體卡拉膠、果膠及瓜爾膠對提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩定性具有一定的作用，其中卡拉膠的穩定性作用效果最佳。經過冷凍干燥后的水溶性蛋白溶液的蛋白組成與未經過冷凍干燥的水溶性蛋白溶液蛋白組成存在一定差異，同時卡拉膠對其穩定性作用也存在差異，在熱處理條件下，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對未經過冷凍干燥處理的WSP穩定性作用逐漸增強，而對經過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩定性作用則呈先增強后減弱的趨勢。