menA過表達菌株構建及兩階段pH控制促進VK2合成

劉 艷， 楊自名， 薛正蓮， 楊超英， 胡劉秀， 程良成，王 洲， 丁秀敏

（1.安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖241000；2.蕪湖張恒春藥業有限公司，安徽 蕪湖241009）

維生素K2（MK，VK2）是一類重要的甲萘醌系列脂溶性維生素，在醫藥和食品領域都有重要應用。健康人群適量補充富含維生素K2食品，可有效減少骨折發病率[1]。研究發現，日本兒童沒有其它國家兒童普遍存在的生長痛，是因為從小吃納豆，而納豆中富含維生素K2，導致兒童的骨密度高、骨骼強壯。另外，對于不足6個月大的嬰兒來說，維生素K缺乏引起的嬰兒出血疾病是一個非常嚴重的世界性問題[2]。并且，近幾年國內外學者在Science和Nature等頂級國際期刊發表的研究報道都表明，同輔酶Q相似，維生素K2作為一種膜結合電子載體，具有修復損傷細胞線粒體的功能[3-5]，這對于人類免受帕金森癥折磨起著重要的作用。基于這3方面的應用，國際市場對功能性食品維生素K2的需求量近年來不斷增長。

由于化學法合成維生素K2存在安全問題，在歐盟和部分亞洲國家被限制不能直接將其用于食品中；此外，微生物發酵合成維生素K2，因具有反應條件溫和、發酵原料價格低廉、環境污染小，同時因為原料來源于生物，合成的產品具有高生物活性和高生物相容性等優點，成為維生素K2合成的首選方法。國內外用于合成維生素K2的菌株主要有黃桿菌和納豆芽孢桿菌，分別生產在C3位側鏈上帶有4個和7個異戊二烯單位的維生素K2同系物 （MK-4和MK-7）[6-18]。MK-7在人體血液中具有較長的半衰期[19]，并且納豆芽孢桿菌來源于食品，因此利用納豆芽孢桿菌發酵獲得的維生素K2更有市場前景。

隨著分子生物學技術的快速發展和基因組測序技術的進步，菌體內維生素K2的基礎代謝研究也在不斷被推進和深入。維生素K2的化學結構式為2-甲基-3-烯基-1，4-萘醌，分別由主鏈 1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA）和側鏈聚異戊二烯組成（圖 1（a））。1982年Bentley和Meganathan詳細綜述了維生素K2在細菌體內生物合成途徑中的代謝中間物、關鍵酶以及催化反應機理，提出維生素K2中主鏈底物萘醌骨架主要通過莽草酸途徑（圖1（b）），由men系列基因編碼的酶系催化合成[20]；乙酰CoA進入甲羥戊酸途徑形成側鏈底物聚異戊二烯焦磷酸（OPP）。作為橋連主鏈和側鏈底物合成維生素K2的酶，過量表達1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉移酶（MenA）對于促進維生素K2在菌體內的代謝合成具有十分顯著的效果[21-22]。然而，目前的研究還只限于大腸桿菌和解淀粉芽孢桿菌，并且也尚未見有對menA基因過表達菌株進行深入地發酵過程調控方面的研究。

圖1 維生素K2化學結構式及代謝合成途徑Fig.1 Structure formula of vitamin K2and its metabolic pathway

作者考察了納豆芽孢桿菌menA基因過表達對維生素K2合成能力的影響，檢測并分析恒定pH對分批發酵培養過程中維生素K2合成動力學參數，并在此基礎上提出兩階段pH控制策略，為維生素K2的大規模生產提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與質粒 納豆芽孢桿菌為本實驗室誘變獲得。大腸桿菌BH5α，質粒pHY-P43保藏于本實驗室。

1.1.2 培養基 斜面培養基（g/L）:牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂粉 20；pH 7.0~7.2。

種子培養基（g/L）:甘油 10，蛋白胨 10，NaCl 5；pH 7.2~7.4。

發酵培養基（g/L）:甘油 10.5，K2HPO4 0.4，蛋白胨 20，酵母提取物 25；pH7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件 種子培養:按照108個/mL的接種量吸取菌體溶液于100 mL種子培養基中，37℃，200 r/min搖床培養36 h。

搖瓶發酵培養:將5 mL種子液接入含100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，37°C，200 r/min搖床培養80 h。

5 L發酵罐小試發酵:種子液培養24 h后以10%體積分數的接種量倒入發酵罐中，裝液量為2 L，控制通氣量為1.0~2.0 vvm，200 r/min 37°C下發酵80 h。每間隔8 h測定發酵過程中各項生化指標，包括培養基中殘余甘油量、菌體生物量、pH變化和維生素K2含量等。

1.2.2 menA過表達菌株的構建 以納豆芽孢桿菌全基因組為模板，PCR擴增得到menA基因片段，設計引物序列如下:

擴增得到的PCR產物與質粒pHY-P43連接，得到重組質粒pHY-P43/menA。酶切連接后獲得含有menA基因的重組表達質粒。參照經典的芽孢桿菌轉化法（即spizizen轉化法）[23]，上述構建好的重組質粒經酶切驗證正確后，轉化到B.subtilis natto菌株中，挑取陽性克隆。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測定 取一定量發酵液于8 000 r/min下離心10 min，下層沉淀用水洗滌2~3次，105°C烘至恒重后稱重。

1.3.2 甘油含量的測定[24]不同比色管中分別放置不同濃度的甘油標準品溶液各1 mL，然后分別加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻后室溫放置10 min，然后加入2 mL 0.1 g/dL L-鼠李糖溶液，再分別加入4 mL Nash試劑，53°C水浴中加熱15 min后于412 nm處測其吸光度。以甘油不同濃度為橫坐標，吸光值OD為縱坐標，作甘油濃度對OD的標準曲線。8 000 r/min離心發酵后的培養基5 min，上清液稀釋至適當的濃度，按照甘油標品檢測方法，利用標準曲線計算發酵液中甘油的含量。

1.3.3 維生素K2提取及檢測 吸取10 mL納豆芽孢桿菌發酵液，并加入異丙醇和正己烷的混合液（1∶2∶4，體積比），搖床220 r/min震蕩30 min后靜置分層，取上清液旋蒸，記錄產物的質量并用異丙醇將其洗出，定容到10 mL的棕色容量瓶中。高效液相色譜進行維生素K2的定量檢測。液相色譜工作條件[14]:色譜柱:Brava-BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相:甲醇∶二氯甲烷=9∶1；流速:1.0 mL/min；進樣量:20 μL；檢測波長:248 nm。

1.3.4 動力學參數計算 利用Origin軟件對菌體生長、產物合成數據進行插值計算（時間步長為0.1 h），擬合得到不同pH下比生長速率μ、維生素K2比合成速率q、菌體得率系數Yx/s、以菌體細胞為基準的產物得率系數YP/x、生物量生成速率Qx、產物比生成速率QP。計算公式分別為:

其中，x為菌體質量濃度 （g/L）；p為維生素K2質量濃度（mg/L）；s為發酵液中殘留甘油質量濃度（g/L）；t為時間（h）。

2 結果與分析

2.1 menA過表達菌株的構建及驗證

以提取得到的納豆芽孢桿菌全基因組 （圖2（a））為模板，通過PCR擴增獲得menA片段（圖2（b）），與pHY-P43質粒連接，得到重組質粒pHY-P43/menA。重組質粒轉入納豆芽孢桿菌后，挑取陽性克隆并提取其中的重組質粒，KpnI和EcoRI雙酶切，酶切后電泳圖如圖2（c）。重組質粒的單酶切產物約6 000 bp，雙酶切產物中大片段與pHY-P43質粒的雙酶切產物堿基對數相近，在5 100 bp左右；小片段約885 bp，與menA基因堿基對數相仿。由此我們認為pHYP43-menA重組質粒構建成功。重組質粒pHYP43-menA經上海生工測序，測序報告中menA序列與NCBI數據庫中menA基因序列比對結果100%相同，再次驗證了menA基因在構建過程中沒有發生突變。Western blot驗證帶有空載體納豆芽孢桿菌、原始菌以及含pHY-P43-menA重組質粒菌株中MenA蛋白表達情況，從圖2（d）中可以清晰看出含pHY-P43-menA重組質粒菌株中MenA表達量明顯高于原始菌和只轉入空載體的納豆芽孢桿菌。含氨芐青霉素抗性的LB培養基平板上篩選含pHY-P43-menA重組質粒的陽性菌株，劃線轉接3次陽性單菌落，均能提取得到重組質粒pHY-P43-menA，說明該菌株可用于下一步發酵。

圖2 基因組DNA、PCR產物、雙酶切產物電泳圖以及western blot檢測結果Fig.2 The electrophoresis results of genomic DNA,PCR product,restriction enzyme digestion and result of western blot.

2.2 納豆芽孢桿菌產維生素K2分批發酵過程

通過5 L發酵罐小試，原始菌和menA基因過表達菌株均于8 h進入對數生長期迅速生長，40 h時進行穩定生長期（圖3）。2株菌均在40 h開始在體內大量累積維生素K2，72 h左右其質量濃度趨于穩定。說明該次級代謝物與其結構類似物輔酶Q10相似，不屬于生長耦聯型[25]。menA過表達菌株在合成維生素K2的過程中，菌體生成、底物（甘油）消耗、產物（維生素K2）合成均與原始菌呈現相似的趨勢，說明menA基因的過量表達并沒有對菌體生理特性造成影響。雖然menA基因過表達菌株的生物量與較原始菌相比略有下降（（6.84±0.28） g/L vs（7.86±0.31） g/L)，但維生素K2合成量卻是原始菌的1.51倍（（38.07±1.81） mg/L vs （25.21±0.81） mg/L)，說明 menA 的過量表達對提高納豆芽孢桿菌體內側鏈底物DPP與主鏈底物1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA）結合能力，促進維生素K2的代謝合成具有非常重要的意義。Kong等同樣發現menA過表達能將大腸桿菌合成維生素K2的能力提高2倍，遠遠高于單獨過表達men家族的其它基因[22]。并且，作者前期的研究發現在黃桿菌中4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉移酶（UbiA）某些氨基酸位點的突變會導致MenA蛋白表達量的增加，而MenA蛋白表達量的增加最終能提高維生素K2的合成量[26]。因此，接下來我們針對menA過表達菌株，對其發酵過程進行研究，以期進一步提高維生素K2的產量。

圖3 原始菌和menA過表達菌株產維生素K2分批發酵過程曲線Fig.3 Batch fermentation time course of vitamin K2 production by original and menA over-expression strain of Bacillus subtilis natto

2.3 不同pH下過表達菌產維生素K2發酵過程曲線及動力學參數比較

整個發酵過程中培養基pH值在持續下降，而菌體生長和次級代謝產物生成的最適pH值往往不同，見圖 3（a）和 3（b）。 因此，作者考察了在分批發酵過程中恒定發酵液的pH，分別恒定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，得到的發酵過程曲線見圖4。可以看出，不同pH下menA基因過表達菌株與原始菌在菌體生長與維生素K2合成曲線上的趨勢基本對應相同。在pH為7.0時生物量相對較高，為（8.91±0.31）g/L。pH為6.0時次之，并且生物量隨著pH值的下降，也在不斷降低。說明培養基的酸性越大越不利于菌體生長。然而，與生物量的變化趨勢不同，維生素K2合成量隨著pH值的不斷下降，呈現出先上升后下降的趨勢。維生素K2合成量最高值（30.23±0.44）mg/L出現在pH值為4.0時。也就是說，雖然pH 4.0不能保證最大的菌體生成量，但最有利于維生素K2合成。由于是胞內產物，而相對較少的生物量也限制了維生素K2的大量合成。這說明單一pH不能同時保證最大菌體生長和次級代謝產物得率。

圖4 不同恒定pH條件下維生素K2發酵過程曲線Fig.4 Time courses of vitamin K2production by Bacillus subtilis natto at various pH value

圖5 不同恒定pH值下納豆芽孢桿菌產維生素K2的動力學參數比較Fig.5 Comparison of kinetic parameters in vitamin K2 production by Bacillus subtilis natto at various constant pH value

圖5和表1列出了pH為3.0~7.0時的發酵過程動力學參數。通過比較可以發現，比生長速率μ和維生素K2比合成速率q在不同pH下的變化趨勢相似。不同pH下μ都在發酵前期（24 h）達到最大值，而q的最大值出現在發酵后期（48 h）。原因可能是發酵前期主要用于合成菌體和初級代謝產物，當二者達到一定值后，菌體以前期積累的初級代謝產物為前體，啟動合成次級代謝物。與其它pH值相比，當 pH 為 7.0 時，μmax（0.129 h-1）最高。生物量生成速率Qx同樣在pH為7.0時數值最高，為0.11 g/L·h。菌體進入穩定期的時間為40 h，說明在發酵前期（40 h）控制pH在7.0有利于菌體充分生長。相較于pH7.0，pH為4.0時菌體的比生長速率μmax和生物量生成速率Qx均較低，分別為0.079 h-1和0.05 g/L·h，但是q在整個發酵過程中都較高，且增加幅度隨著時間的延長，也在逐漸增大，增幅明顯高于其它pH下的對應值，在48 h達到最大值0.222 mg/g·h。這說明pH為4.0雖然不利于菌體生長，但卻促進了維生素K2的生成。以上結果表明，發酵過程中設定單一pH，不能使菌體生長和產物合成都能達到最理想狀態。

2.4 兩階段pH控制策略強化納豆芽孢桿菌發酵產維生素K2

為保證菌體在充分生長的同時提高維生素K2合成量，從上述分析中提出一種兩階段pH控制策略:在發酵前期0~40 h控制pH 7.0，在發酵后期40~80 h控制pH恒定為4.0進行分批發酵。由圖6和表2可知，在發酵前期菌體生長速率較pH自然狀態下明顯提高，最大生物量達到了（11.46±0.67）g/L，比menA過表達菌pH自然狀態下的最大生物量提高了67.54%，比原始菌提高了45.80%。值得一提的是，當經過過表達menA基因，并采用了兩階段pH控制后，維生素K2的產量有了大幅度提高，分別是原始菌和過表達菌自然狀態下的2.6和1.7倍。說明在此策控制策略下，不僅提高了菌體生物量，還提高了維生素K2產量，為大規模生產維生素K2提供了基礎條件。李珊等[27]發現兩階段pH控制對于哈茨木霉合成β-1，3-葡聚糖內切酶同樣具有非常明顯的促進作用，說明該策略在提高特定發酵產品總體產量方面具有一定的適用性。

表1 不同pH下維生素K2分批發酵過程動力學參數比較Table 1 Comparison of fermentation kinetic parameters at various pH value

表2 不同發酵過程下維生素K2發酵動力學參數比較Table 2 Comparison of fermentation kinetic parameters at various fermentation process

圖6 兩階段pH控制Bacillus subtilis natto產維生素K2 Fig.6 Time course of vitamin K2production by Bacillussubtilis natto using two-stage pH control strategy

3 結 語

過量表達menA基因能使Bacillus subtilis natto維生素K2合成量提高51%。發酵過程中最適菌體生長和維生素K2合成pH分別為7.0和4.0。作者采用兩階段pH控制策略，將發酵前期0~40 h的pH控制為7.0，確保得到能充分合成維生素K2的菌體量。在發酵后期40~80 h控制pH為4.0，確保在得到最大菌體生物量的同時最大程度合成維生素K2。采用menA過表達和兩階段pH控制，菌體生物量和維生素K2的產量分別達到了（11.46±0.67）g/L和（63.60±1.81）mg/L，分別是原始菌分批發酵pH自然狀態下的1.5倍和2.6倍。