天山1號冰川凍土微生物總DNA提取方法的比較和優化

李 夢， 胡有貞， 唐 潔， 王麗軍， 鄭曉吉， 顧艷玲， 關 波， 倪永清

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832002）

天山1號冰川凍土屬于我國高海拔高山多年凍土類型，分布于烏魯木齊河源天山冰川站及空冰斗地區，海拔3 250 m以上，年平均地溫為-4.95℃[1]。凍土環境中的微生物需要通過各種生理機制適應低溫、寡營養、強輻射、凍融等一系列極端環境。凍土微生物的這些極端生理特性為研究和開發利用參與代謝過程的低溫酶提供了豐富的材料。已有研究對天山1號冰川凍土中產低溫β-半乳糖苷酶的微生物進行篩選，本課題組從天山1號冰川凍土中分離獲得產低溫β-半乳糖苷酶、低溫脂肪酶、低溫蛋白酶和低溫淀粉酶的菌株。然而，由于冰川凍土有機質營養十分貧瘠，從中分離的寡營養型微生物在現有培養技術條件下普遍生長速率較慢，產酶水平較低（僅約1～5 U/mL），嚴重限制了低溫酶的高效篩選和制備。因此，利用宏基因組學等分子生物學技術，構建冰川凍土的宏基因組文庫進行功能篩選，有助于更高效地從低溫環境中篩選β-半乳糖苷酶。

獲取高質量的宏基因組DNA是構建宏基因組文庫的先決條件。目前對于各類土壤微生物總DNA的提取方法已有較多的報道[2-7]，但在已經報道的提取方法中還沒有一種方法能夠適用于所有環境樣品微生物總DNA的提取。由于冰川微生物生物量相對較低，而且主要以革蘭氏陽性菌為主[8]，本課題組前期嘗試使用商業化提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）和 PowerSoilDNA Isolation Kit（MO BIO）提取的天山1號冰川凍土DNA的得率和純度均無法滿足構建宏基因組文庫的要求。因此，建立一種適用于天山1號冰川凍土的DNA提取方法，對構建冰川凍土的宏基因組文庫及低溫β-半乳糖苷酶的高效篩選具有重要意義。本文對目前報道的幾種土壤DNA提取方法進行了比較，并對最適合天山1號冰川凍土DNA提取的TEN法進行了優化和改良。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

天山一號冰川屬于天格爾山北坡烏魯木齊河的河源區，海拔 3 833 m（43°07.125 N，86°48.707 E）。凍土土壤樣品取自從烏魯木齊天山一號冰川尾部的底部沉積層，用提前滅菌的工具沿冰川邊緣收集土樣。采集的樣品迅速裝入已滅菌的50 mL離心管，置于車載冰箱中-4℃保存。采集的凍土樣品于當天運回實驗室并在-20℃保存備用。

1.2 主要試劑

PCR Taq酶，λ DNA/HindⅢ marker購自大連寶（Takara）生物工程有限公司，FastDigest快速限制性內切酶Bam HI購自賽默飛世爾（Thermo Scientific）公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，蛋白酶K和溶菌酶購自北京康為世紀有限公司，相關生化試劑購自上海生工生物工程有限公司，實驗用到的主要緩沖液及成分如下:

裂解緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaEDTA，100mmol/L Na2PO4，1.5 mol/L NaCl，10 mg/mL CTAB，pH 8.0；

TENP 溶液:50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，10 mg/mL PVPP，pH 10.0；

PBS buffer:8.0 g NaCl，2.0 g KCl，1.44 g

Na2HPO4，0.24 g KH2PO4， 溶于 1 L 去離子水，pH 7.4；

TEN 溶液:100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris（pH 8.0）， 1.5 mol/L NaCl，100 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4；

TE buffer:10 mmol/L Tris-HCl buffer（pH 8.0），1 mmol/L EDTA。

1.3 凍土微生物總DNA的提取方法

1.3.1 SDS-CTAB裂解法 參考趙裕棟等的方法[9]，略有調整。稱取5.0 g土壤樣品于50 mL離心管中，加10 mL裂解緩沖液，振蕩混勻。向樣品中加100 μL溶菌酶（質量濃度為250 mg/mL），混合均勻，37℃恒溫水浴1 h，每15 min溫和震蕩混勻1次；加50 μL蛋白酶 K（10 mg/mL），恒溫水浴 1 h；加 100 g/L 十二烷基磺酸鈉（SDS，終質量濃度為40 g/L），65℃水浴2 h，每20 min溫和顛倒混勻 1次；離心，取上清液，上清液中加1/5倍體積的氯仿（提前預冷），輕微振蕩混勻，25℃ 8 000 r/min離心15 min，取上清液；向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃、2 h沉淀DNA；4℃，10 000 r/min離心20 min，棄去上清液，保留 DNA沉淀。體積分數70%冰乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加100 μL TE溶解DNA，于-20℃保存。

1.3.2 TENP法 參考趙勇等方法[10]，略有改動。預處理:取5.0 g土壤，于50 mL離心管中，加10 mL的TENP buffer，振蕩混勻，離心 10 min（10 000 r/min，25℃），去上清液。沉淀中再加10 mL的TENP buffer，振蕩混勻，離心 10 min（10 000 r/min，25 ℃），棄上清液。重復上述步驟直至上清透明，加入5 mL的PBS buffer按上述操作洗滌，保留沉淀。DNA提取:將收集的沉淀懸浮于10 mL裂解緩沖液 （同SDS-CTAB裂解法），37℃水浴45 min；加 50 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 100 μL 溶菌酶（250 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 2 mL 100 g/L SDS，65℃水浴 2 h。8 000 r/min、25℃離心 10 min，將上層液相轉入另一潔凈的50 mL離心管，加等體積氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），10 000 r/min、25 ℃離心15 min。取上層清液，向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃沉淀2 h；10 000 r/min、4℃離心20 min，體積分數70%冰乙醇洗滌沉淀3次，洗滌后自然風干2 h，待乙醇風干后，加100 μL TE，得到DNA溶液-20℃保存。

1.3.3 TEN法 參考Fang等方法[11]，略有改動。稱取5.0 g土壤樣品，加入10 mL TEN溶液，將樣品完全懸浮到TEN溶液中，反復凍融（-80℃，10 min；65℃，5 min）3 次后；再加入 100 μL 溶菌酶（250 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加入 10 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），37℃水浴30 min。酶解后在試樣中加入2 mL預熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴2 h，期間每15 min輕輕上下顛倒一次。10 000 r/min，25℃離心10 min后，將上清液轉移到新的離心管中，土壤顆粒裂解后沉淀于4℃保存備用。向上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），混勻后，10 000 r/min，25℃離心10 min，收集水相。向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃沉淀2 h，10 000 r/min、4℃離心20 min，棄上清液，體積分數70%冰乙醇洗滌沉淀3次，室溫晾干，加100 μL無菌TE溶解DNA。

1.3.4 Zhou法[12]稱取5.0 g土壤樣品，研碎，于50mL離心管中，加13.5mL裂解緩沖液，振蕩混勻；加100 μL蛋白酶 K（10 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 1.5 mL 200 g/L SDS，混勻，65℃水浴2 h，間或混勻；8 000 r/min、25℃離心20 min，將上層液相轉入另一潔凈的50 mL離心管于4℃備用；土樣沉淀再加4.5 mL裂解緩沖液和0.5 mL 200 g/L SDS混勻，于65℃，10 min后，離心；上清液與前一次上清合二為一，加等體積氯仿異戊醇抽提，8 000 r/min、離心10 min；取上層清液，加入0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h；10 000 r/min、25℃離心20 min，體積分數70%乙醇洗滌沉淀3次，自然風干，加100 μL TE。

1.3.5 TEN法的改良和優化 1）反復多次提取對提取效率和質量的影響。以TEN法首次裂解后的含細胞裂解物沉淀作為第2次DNA提取樣品，按TEN法反復提取1次 （在提取樣品中加入2 mL預熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴30 min，其余不變），記為TEN1法。以第2次裂解后的含細胞裂解物沉淀作為第3次DNA提取樣品，再用TEN方法重復提取 1次，記為TEN2法。2）向TEN法首次裂解后的土壤顆粒沉淀中加入4 mL TEN溶液，并反復凍融（-80 ℃，10 min；65 ℃，5 min）3 次后，再加入1 mL預熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴30 min，8 000 r/min離心15 min后的上清液與第1次離心獲得的上清液合并后，進行核酸沉淀，后續操作方法與TEN法相同，記為TEN3法。3）預處理對提取效率和質量的影響。取2組凍土樣品分別不進行預處理和進行預處理（將土壤顆粒重懸于10 mL TEN溶液中，25℃、150 r/min、10 h后，將混合物離心，收集沉淀。再重復用TEN溶液洗沉淀2～3次，直到懸浮液無色澄清）后按TEN3法提取 （預處理記為TEN4）每個處理至少做3個平行實驗。

1.4 凍土微生物總DNA完整性及純度和得率的檢測

提取的凍土微生物核酸樣品用NanoDrop2000超微量分光光度計測定230、260、280 nm處的光吸收和核酸濃度。以A260/A280和A260/A230的比值來評價DNA的純度。此外，取10 μL提取的凍土微生物核酸樣品，1 g/mL瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE緩沖溶液，8 V/cm，45 min）檢測DNA片段的完整性和含量。

1.5 凍土微生物總DNA的PCR擴增

以提取的凍土微生物總DNA為模板，分別擴增16s rDNA和26s rDNA片段，分析凍土微生物總DNA 的提取質量。 擴增體系（20 μL）:10×Taq PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物（表 1）各 1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，凍土微生物總DNA溶液1 μL，其余用滅菌雙蒸水補齊。PCR反應的陰性對照用無菌雙蒸水代替DNA模板。擴增條件:95℃預變性5 min；95℃變性 30 s；56℃退火 30 s；72℃延伸 1 min；30個循環；72℃延伸10 min。反應在PCR儀（TC512型，英國Techne公司）上進行。PCR產物用1.0 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列及PCR產物Table 1 Primes sequences and PCR product

1.6 凍土微生物總DNA的限制性酶切

凍土微生物總DNA的酶切按照FastDigest快速限制性內切酶Bam HI的推薦酶切體系進行酶切，在37℃水浴酶切指定時間后，80℃，5 min滅活后進行瓊脂糖凝膠電泳。

表2 不同提取方法獲得的DNA得率和純度比較Table 2 Comparison of yield and purity of DNA obtained by different extraction methods

2 結果與分析

2.1 不同凍土微生物總DNA提取方法的比較

土壤 DNA的得率和純度是評價DNA提取方法的2個重要指標。4種方法所提DNA的含量和純度的測定結果見表2。從表2中可以看出，3次平行實驗中TEN法提取DNA的得率最高，為（392±44）ng/g凍土。SDS-CTAB法和TENP法的得率最低。與一般土壤中 DNA 得率（95.67 ±1.56） μg/g土壤相比[10]，凍土中DNA的得率明顯偏低，這可能由于冰川凍土中微生物生物量較低或凍土微生物細胞的裂解效率較低。從表2中可以看出，4種提取方法所得DNA的A260/A230比值均小于1.0，說明提取DNA中雜質成分仍較多。從A260/A280上看，TEN法提取DNA的A260/A280的比值最接近理想指標。

利用瓊脂糖凝膠電泳對4種提取方法所提DNA進行了完整性檢測，結果如圖1所示。除了TENP法外，其余的3種方法提取的DNA電泳后均得到明顯的主條帶，主條帶相對分子質量在 10×103～23×103之間。

圖1 不同方法提取的凍土基因組DNA凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis result of genomic DNA extracted from frozen soil samples by different methods

4種提取方法都有不同程度的降解現象，但TEN法的主條帶最亮。綜合考慮不同提取方法獲得DNA的得率、完整性和純度，本研究選擇TEN法做了進一步優化。

2.2 TEN法反復多次提取DNA和改良TEN法的得率和純度分析

為了進一步提高TEN法的DNA提取得率，用TEN法對同一份天山冰川凍土樣品進行了反復提取，同時采用改良后的TEN3法提取。TEN3法和反復提取3次后的DNA得率及純度匯總在表3。同一樣品反復通過TEN法進行提取3次獲得的DNA（對應 TEN、TEN1、TEN2） 得率依次為 （383±57）、（410±72） ng/g和（61±15） ng/g凍土，而 A260/A280逐漸升高，這表明單次提取無法完全獲得凍土樣品中的所有DNA，反復多次提取同一樣品后DNA中的雜質成分逐漸減少。TEN3法參考Zhou法將2次細胞裂解產物合并進行DNA抽提，得率達到（413±91）ng/g 凍土，A260/A280和 A260/A230分別為（1.76±0.04）和（1.08±0.24）。對所提基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測結果如圖2所示，提取的DNA電泳后均得到較清晰的主條帶，相對分子質量接近23×103。但由于凍土土壤中微生物的分布存在著不均一性，而在提取過程中可能又因物理機械剪切的作用而使基因組DNA有不同程度的降解。因此，后續實驗選擇對TEN3法進行了優化。

表3 TEN法反復多次提取DNA和TEN3法的得率和純度Table 3 DNA yield and purity extracted by the TEN method repeatedly and TEN3 method

圖2 TEN3法和TEN法反復多次提取凍土的基因組DNA凝膠電泳Fig.2 Electrophoresis result of genomic DNA repeatedly extracted from frozen soil samples by different TEN method

2.3 樣品預處理對DNA提取得率和純度的影響

為分析預處理步驟是否能夠提高TEN法提取DNA的得率和純度，分別取3份凍土樣品進行預處理，3份凍土樣品不進行預處理提取總DNA。從表4可以看出，相比未經預處理樣品，經預處理的樣品提取 DNA的得率從 （424±76）ng/g凍土增加到（449±61）ng/g。未經預處理提取的DNA和預處理提取DNA的A260/A280均在1.8～2.0之間，但預處理提取的DNA其A260/A230值達到了2.03±0.31。

表4 TEN3法預處理對DNA得率與純度的影響Table 4 Effects of pretreatment with TEN buffer on the DNA yield and purity

2.4 改良TEN法提取DNA質量的PCR檢測和限制性酶切檢測

為驗證提取的DNA質量是否滿足后續分子生物學實驗的要求，采用16S rDNA和26S rDNA引物PCR擴增進一步驗證了提取的凍土宏基因組DNA質量（圖3）。結果顯示4種方法提取的DNA樣品均可成功擴增出16S rDNA產物，但SDS-CTAB法、Zhou法和TENP法提取的部分DNA樣品沒有成功擴增出26S rDNA產物。采用TEN方法反復多次提取的DNA樣品均能成功擴增出16S rDNA和26S rDNA產物，擴增產物的瓊脂糖電泳條帶單一，分別約為1 400 bp和500 bp，與預期大小一致。

圖3 16S rDNA和26S rDNA引物PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification using 16S rDNA and 26S rDNA primers

分別對TEN3法、TEN4法和TEN1法獲得的DNA樣品進行限制性酶切，實驗結果（圖4）顯示經Bam HI部分酶切后TEN3法基因組DNA的主條帶降解不明顯，而TEN1法提取基因組DNA和TEN4法的主條帶降解明顯，表明TEN1法和TEN4法獲得的DNA滿足限制性酶切的要求。進一步驗證了，增加預處理的方法可以提高核酸的得率和純度。但由于通過綜合考慮到TEN4法核酸的得率相對較高，損失較少，更能展示生物的多樣性，所以采用TEN4法從天山1號冰川凍土中提取的總基因組DNA質量滿足后續分子生物學實驗的要求。

圖4 提取凍土基因組DNA的限制性酶切分析Fig.4 Restriction digestion analysis of genomic DNA extracted from frozen soil samples

3 討論

天山1號冰川凍土環境中的微生物通過產生低溫酶等多種機制適應低溫環境，這為挖掘各類低溫酶提供了極好的研究材料。課題組已從天山1號冰川凍土中分離獲得產低溫β-半乳糖苷酶、低溫脂肪酶、低溫蛋白酶和低溫淀粉酶的菌株[13-16]。據估計，環境樣品中可分離培養微生物僅占總微生物的1%，通過現有標準培養方法無法進行培養微生物的種類更占到環境中所有微生物種類的99%以上[8]。近年來，極端微生物的研究已經成為熱點，特別是它們所具有的獨特基因[17-19]。冰川凍土由于有機質營養十分貧瘠，分離獲得的低溫微生物在現有培養技術條件下普遍生長速率較慢，產酶水平較低（僅約1～5 U/mL），嚴重限制了低溫酶的高效篩選和制備。因此，需要采用基于宏基因組文庫的分子生物學方法更高效的從天山冰川凍土中挖掘酶學特性優良的低溫酶，并構建相應的基因工程菌以實現低溫酶的高效制備。

構建宏基因組文庫的重要前提是獲取高質量的宏基因組DNA。盡管目前針對多種土壤樣品都有相應的DNA提取解決方案，但還尚未報道一種可適用于所有土壤的高效方法。課題組前期采用商業化提取試劑盒 （MP Biomedicals公司的FastDNA SPIN Kit for Soil和MO BIO公司的PowerSoil DNA Isolation Kit）進行提取發現，試劑盒提取單次土壤樣品處理量小（0.5 g提取樣），并且提取的天山1號冰川凍土DNA無法滿足構建宏基因組文庫的要求并且價格昂貴。因此，本文以天山1號冰川凍土為提取材料，對現有的幾種土壤DNA提取方法進行了比較，并從中選擇了DNA提取純度和得率相對較高的TEN法進行了進一步的優化和改良。

土壤DNA的手提方法通常包括直接法和間接法兩類，間接法通常從土壤樣品中回收細胞后再提取DNA，純度高但得率低，往往不能包括真菌和細菌總DNA[7]。直接法是直接裂解土壤樣品中的微生物，通常包括預處理、細胞裂解、蛋白質抽提和DNA沉淀幾個基本環節。為了獲得較高的DNA提取效率，通常采用預處理過濾除掉一些大的顆粒雜質，并利用預處理液中的CTAB或PVPP等成分充分吸收土壤中的腐殖酸等雜質[12]。本研究中TENP法將PVPP加入預處理中，結果核酸的純度和得率并不理想。推測可能是由于預處理液中殘留的PVPP阻礙了后續的微生物細胞裂解，導致DNA提取得率最低。

為了獲得最佳的細胞裂解效果，許多研究都采用物理、化學和水解酶類聯用進行細胞裂解[9]。本研究（SDS-CTAB法）發現單純采用CTAB對細胞進行裂解，效果并不好；Zhou法DNA的得率和純度也并不理想；而TEN法主要通過溶菌酶+蛋白酶K+反復凍融+SDS破碎裂解細胞，把物理、生物和化學的方法結合起來，提高了細胞的裂解效率，在4種手提方法中TEN法提取的DNA得率最高，純度也相對較高（表2）。DNA粗可體液通過吸附柱等方法進一步純化，但通常對不同相對分子質量DNA的吸附具有一定的選擇性，不利于宏基因組文庫的構建[5]，因此本研究綜合考慮DNA的純度和完整性，選擇TEN法進行了進一步的優化和改良。

已有文獻表明同一土壤樣品反復提取3次后能夠較好地表征土壤微生物的數量和物種組成，現有的DNA提取方法似乎很難一次性將所有土壤微生物細胞裂解并獲得DNA[20-21]。本研究的結果也表明反復提取3次均能從天山1號冰川凍土樣品中提取出不同含量的DNA，但以TEN1法的得率和純度最高。TEN3法則參考了Zhou法中一次提取過程將2次細胞裂解物成分合并后一并進行DNA抽提的策略，所提DNA的總體得率不如分2次提取（TEN+TEN1）的總得率高，但由于進行了多批次細胞裂解，所提DNA更能體現凍土中微生物的天然組成。因此，最終選擇了TEN3法的樣品進行后續實驗。Fang等提取河床沉積物DNA時發現TEN法預處理有助于提高DNA的純度和得率[12]，本文的結果也表明預處理后TEN法提取的凍土DNA其A260/A230值達到了（2.03±0.31），提取DNA的純度明顯提高。

16S rDNA和26S rDNA的PCR擴增結果顯示預處理改良TEN法提取的DNA質量相對較高，表明該方法能從凍土中同時有效提取細菌和真菌總基因組DNA。預處理改良TEN法提取DNA的限制性酶切效果明顯，提取所獲得DNA滿足構建天山冰川凍土微生物宏基因組文庫的要求。

4 結 語

本研究通過對現有幾種土壤樣品DNA提取方法的比較和優化，建立了一種適合天山1號冰川凍土樣品微生物總DNA提取的有效方法——預處理改良TEN法，為后續天山1號冰川凍土宏基因組文庫的構建和低溫乳糖酶的篩選奠定了基礎。