毛建草莖段愈傷組織的誘導及繼代培養試驗

宗 越，郭曉紅，田旭平

（山西農業大學林學院，山西太谷030801）

毛建草（Dracocephalum rupestre Hance），又稱毛健草，學名巖青蘭，唇形科青蘭屬植物。根莖直，生出多數莖。莖不分枝，葉片三角狀卵形，輪傘花序密集，花冠紫藍色，花期7—9月[1]。全草具香氣，可入藥，也可代茶飲[2]。因其花顏色是藍紫色，具有一定的觀賞性，在園林綠化中可作花帶、花鏡、花壇栽培。山西毛建草多為野生資源，野生毛建草基本靠莖的伸長來繁殖。人工栽培主要通過種子繁殖，但種子小且成熟時易脫落，不易采集，所以，毛建草的種子繁殖有一定的局限性。而植物組織培養技術不僅可以避免自然條件帶來的限制，還可以在短時間內利用最少的植株材料大規模的實現毛建草的組培苗繁殖[3-5]。

本研究選取毛建草莖段為外植體材料，通過對其愈傷組織誘導及繼代培養，篩選出毛建草愈傷組織誘導及建立植株再生體系的最適激素濃度組合，從而為毛建草的研究提供理論及實踐依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為毛建草幼嫩的莖段，毛建草均來自于太谷縣山西農業大學林業站。

1.2 外植體處理

2018年5月21日在山西農業大學林學院實驗室將采摘的毛建草莖段清洗干凈后置于流水下沖洗1 h，然后在無菌條件下用75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～4次，再用1%的升汞浸泡7 min，之后再用無菌水沖洗3～4次。在超凈工作臺上，用手術刀將毛建草莖段切成1 cm左右的小莖段，用鑷子將小莖段接種至培養基，每個培養基中放6個小莖段。

1.3 試驗設計

采用MS培養基為基本培養基。愈傷組織誘導培養基配方：6-BA質量濃度分別為0.5，1，2 mg/L，NAA質量濃度分別為0.2，0.5，1 mg/L，共9個處理，5次重復。35 d后觀察并統計莖段愈傷組織的誘導情況。繼代培養基配方：6-BA質量濃度分別為0.5，1，2 mg/L，NAA 質量濃度分別為 0，0.05，0.1 mg/L，共9個處理，5次重復。20d后觀察并統計愈傷組織的繼代培養情況。培養基均添加蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L；pH值5.8～6.0，高壓滅菌鍋滅菌。培養溫度25℃左右，光照時間15 h/d，光照強度4 000 lx。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導

7 d后愈傷組織形成，呈淺綠色（圖1-A）；15 d后愈傷組織增大，表面覆蓋少許白點（圖1-B）；25 d后愈傷組織繼續增大，呈深綠色（圖1-C）；35 d后愈傷組織不再增大，表面呈黃綠色（圖1-D）。結果表明，Y1，Y2處理的愈傷組織的誘導率較高，而且Y2處理的愈傷組織的生長狀態最好，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L為誘導毛建草莖段愈傷組織的最適培養基（表1）。

表1 2種激素配比對莖段愈傷組織誘導的影響

2.2 繼代培養

選擇生長狀態良好的愈傷組織轉接到以MS培養基為基本培養基，附加6-BA，NAA 2種激素配比的繼代培養基上進行增殖培養，發現愈傷組織在9種繼代培養基上進一步增殖分化出根，而不是芽（圖 2）。

由表2可知，愈傷組織在N2，N3處理中生根率較高，但N2處理中不定根生長較粗壯且數量多，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L為誘導毛建草愈傷組織不定根的最適培養基。

表2 2種激素配比對愈傷組織繼代培養的影響

3 結論與討論

3.1 愈傷組織的誘導

誘導毛建草愈傷組織的培養基選擇6-BA與NAA2種激素的配比組合，結果顯示，6-BA與NAA的濃度均較小時，其愈傷組織的誘導率高；6-BA質量濃度高時容易造成毛建草莖段的褐變死亡，導致愈傷組織的誘導率降低。蔡漢權[6]在利用羅勒頂芽和帶腋芽莖段進行愈傷組織誘導時發現，6-BA質量濃度為4 mg/L，NAA質量濃度為0.1 mg/L時，羅勒的愈傷組織誘導率最高，達95%；廖蘇梅等[7]對薰衣草的種子在6-BA質量濃度為2，4 mg/L時分別進行了愈傷組織的誘導，對比發現6-BA質量濃度高時，外植體的致死率較高，愈傷組織誘導率低；談永霞[8]利用百里香莖段誘導愈傷組織時發現，6-BA質量濃度為1 mg/L時，該愈傷組織誘導率最高。以上結果說明，唇形科的植物在誘導愈傷組織形成時，6-BA質量濃度相對較小時誘導率高。本試驗只對6-BA與NAA這2種生長調節劑進行了篩選，其他生長調節劑的組合有待進一步研究。

其次，愈傷組織的誘導率與外植體的選材部位及采集時間有關系[9-10]。劉艷芬等[11]對大葉蒲公英的葉片進行愈傷組織誘導時發現，含葉脈處比不含葉脈處愈傷組織發生速度快，愈傷組織面積大。劉軍等[12]利用美國薄荷的莖段及葉片進行組織培養時發現，美國薄荷的莖段出愈率高于葉片。溫琳等[13]對半夏葉柄進行愈傷組織誘導時發現，材料的采集時間與愈傷組織的誘導率有明顯關系，出苗期及生長旺盛期材料分生能力較強，珠芽成熟期及倒苗期材料分生能力弱。以上結果說明，外植體的選材部位及采集時間對愈傷組織的誘導有影響。

3.2 繼代培養

本試驗的繼代培養基為芽分化培養基，根據文獻記載，當6-BA質量濃度高、NAA質量濃度低時，有利于芽分化。本研究表明，以毛建草莖段為外植體誘導的愈傷組織只分化出了不定根，未分化出叢生芽。莖段愈傷組織未分化出芽的原因可能是外源激素選擇不當或者添加濃度有誤，也可能與溫度、光照等培養條件有關[14]。梁崢等[15]在微型月季叢芽分化試驗中研究發現，6-BA質量濃度在0.1～0.5 mg/L時，植株生長緩慢，叢芽分化很少；當6-BA質量濃度達到1 mg/L時，植株生長旺盛，叢生芽分化較多。王政等[16]對非洲菊組培苗進行不同光源處理研究發現，不同光源對組培苗葉片及根的伸長都有顯著影響。張海龍等[17]在對冰燈玉露組培苗進行研究發現，光照強度對于組培苗生長速度與形態建成有較大影響。黃冰艷等[18]對甘薯莖尖分生組織進行組織培養時，叢生芽的誘導率在光照時間14 h/d條件下要高于10 h/d。

另外一個原因可能與選材有關，有些植株在一定程度上可能很難經過愈傷組織分化增殖而成為一個完整的植株。器官發生是指植物不同器官直接不定芽及不定根分化進而產生完整植株的過程，包括直接和間接2種途徑。前者是外植體直接不定芽及根誘導，后者則需先產生愈傷組織，再不定芽及根誘導[19]。最適宜作為毛建草組織培養及快速繁殖的外植體可能是其帶腋芽的莖段，劉俊等[3]利用毛建草帶腋芽的莖段建立了毛建草的快繁體系；張樹河等[20]利用迷迭香帶腋芽的莖段實現了迷迭香的組培快繁技術。以上研究表明，適宜毛建草快繁體系建立的方式可能是器官發生的直接途徑。該結論有待進一步進行驗證。

本研究表明，毛建草莖段愈傷組織誘導的最適培養基配方為MS＋6-BA0.5 mg/L＋NAA0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6.5 g/L，誘導率高達97%；莖段愈傷組織繼代培養時更容易生根。植物組織培養可以對植物進行工業化生產，不占用耕地，在完全人工控制的情況下不斷進行生產，不受地區、季節、土壤及有害生物的影響。所以，利用組織培養可以實現毛建草的大規模生產。