糜子PmASR2基因克隆與表達(dá)分析

沈力鴻，劉思辰，王海崗，陳 凌，王君杰，曹曉寧，喬治軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031）

作物在自然生長過程中，會受到自然環(huán)境中各種生物脅迫和非生物脅迫（干旱、高溫、低溫、鹽漬等）的影響[1]。隨著全球氣候的極端變化及土地沙漠化和鹽漬化，作物生長環(huán)境被破壞，非生物脅迫已成為限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素[2]。據(jù)統(tǒng)計，干旱造成的農(nóng)業(yè)損失超過其他非生物逆境造成的損失總和[3]。因此，提高作物的抗旱性對提高經(jīng)濟效益有決定性的作用。糜子（Panicum miliaceum L.）屬禾本科黍?qū)伲址Q黍、稷、糜，是干旱和半干旱主要作物[4]。糜子生育期短，具有耐旱、耐瘠薄、干旱后復(fù)水能力強等特性，在遭受嚴(yán)重干旱后遇水能夠快速恢復(fù)生長[5]。同時糜子作為C4作物，在C3作物停止干物質(zhì)積累的水分脅迫條件下，仍能積累干物質(zhì)[6]，是研究作物耐旱性改良的優(yōu)異材料[7]。目前，對抗干旱脅迫的研究主要集中在改良栽培方法上[8]、植物抗旱生理方面[9]以及分子方面[10]。如今，從抗旱作物中篩選出抗旱基因是一項研究熱點。

ASR全名ABA-stress-ripening，即ABA脅迫成熟響應(yīng)蛋白，1993年首次在番茄中發(fā)現(xiàn)能被逆境脅迫誘導(dǎo)[11]。目前，ASR基因在谷子中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個[12]，水稻中 6 個[13]，玉米中 9 個[14]。RICARDI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在番茄中l(wèi)sASR1過表達(dá)降低了煙草干旱脅迫期間水分損失率；TaASR1的過表達(dá)增加了煙草干旱脅迫的存活率[16]。在百合和香蕉中研究發(fā)現(xiàn)，ASR基因能賦予擬南芥耐旱性[17-18]；ZmASR1能夠提高作物的抗旱性，從而提高產(chǎn)量[19]。在鹽生植物亞洲落葉松中，ASR1能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的耐性[20]；OsASR1的過量表達(dá)通過增加水稻中光合作用提高了耐冷性[21]；大豆ASR基因表達(dá)可以增強酵母和煙草細(xì)胞抗Cu2+的能力[22]。ASR基因已在多個物種被報道能提高作物抵御非生物脅迫的耐受性，但是在抗逆作物糜子中還未見報道。

本試驗通過克隆糜子PmASR2基因及表達(dá)分析，旨在了解該基因賦予植物對非生物脅迫耐受性的生理和分子機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為河曲紅糜子，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供；所用的克隆載體為pGMSimple-TFast Vector（天根生化北京科技有限公司）；所用的菌種DH5α購自天根生化北京科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗處理 糜子種子用75%的乙醇處理2 min，再用0.1%升汞浸泡5 min后，用無菌水沖洗5次以上，將處理好的種子放入含有充足水分的培養(yǎng)皿中，暗培養(yǎng)下使其發(fā)芽；發(fā)芽后將長勢較好的幼芽放入花盆土培養(yǎng)，在10 000 lx光照16 h黑暗8 h條件下培養(yǎng)10 d后，進(jìn)行脅迫處理。

1.2.1.1 干旱脅迫處理 將糜子幼苗放入10%的PEG6000 中處理，并以水處理為對照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、莖、葉后迅速用液氮冷凍，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.1.2 鹽脅迫處理 將糜子幼苗放入250 mmol/L NaCl中處理，并以水處理為對照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、莖、葉后迅速用液氮冷凍，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.1.3 甘露醇糖處理 將糜子幼苗放入200mmol/L甘露醇中處理，并以水處理為對照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、莖、葉后迅速用液氮冷凍，并放入-80℃冰箱保存，待后續(xù)試驗。

1.2.1.4 激素處理 將糜子幼苗同時放入6種植物激素中進(jìn)行處理（100 μmol/L的脫落酸（ABA），100 μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJa），2 mmol/L的水楊酸（SA），50 μmol/L的生長素（IAA），10 mmol/L的過氧化氫（H2O2），10 mg/L的赤霉素（GA）），并以水處理為對照，在 0，1，3，6，9，12，24 h 剪取糜子幼苗的根、莖、葉后迅速用液氮冷凍，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 植物總RNA提取 植物總RNA提取采用RNA提取試劑盒DP432（天根生化北京科技有限公司），提取后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用FastKing一步法除去基因組cDNA；第1鏈合成預(yù)混試劑（KR118）購自天根生化北京科技有限公司，具體操作依照說明書進(jìn)行。

1.2.3 基因克隆 從NCBI中查找出水稻、谷子、玉米、柳枝稷等作物ASR2家族基因，取其中遺傳較為穩(wěn)定的ASR2基因序列來克隆，然后選取與糜子同源關(guān)系最相近的柳枝稷ASR2基因EST序列為模板在NCBI里面的primer-blast設(shè)計引物，設(shè)計完成后用軟件Primer 5.0檢查該引物的特異性。擴增PmASR2基因共設(shè)計了2對引物，分別為1～432 bp長度的正向引物5-′GGCGAGGTCAACTACGAGA A′-3，反向引物 5-′CAGACAGCACCACACGGTTA′-3；117～541 bp長度的正向引物 5-′CTCCCCTGAC AAGTTCGCA′-3，反向引物 5-′TAGCGCACACGAG TTGAAAG′-3，擴增體系為 50 μL，以不同時間各個處理的糜子葉片cDNA等量混合樣為模板，模板體積 5 μL（100 ng/μL）cDNA 質(zhì)量濃度 100 ng/μL，正反引物各 4 μL（10 mmol/L），2×GC-Rich PCR Master Mix 25 μL（KT206購自天根生化北京科技有限公司），加入ddH2O補足50 μL。PCR反應(yīng)程序為94℃5 min；接著 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共34個循環(huán)；然后72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后取3 μL 產(chǎn)物與 1 μL 6×DNA Loading Buffer混合，在含有1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴增產(chǎn)物檢測。檢測大小片段準(zhǔn)確后，回收并純化目的條帶，連接到克隆載體pGM-Simple-TFast Vector，熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，經(jīng)菌液PCR驗證為陽性克隆子，后送上海美吉生工測序，測序結(jié)果經(jīng)過拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast N比對。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將所得的序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，利用NCBI數(shù)據(jù)庫CD-search在線分析軟件進(jìn)行保守域預(yù)測。利用WoLF PSORT在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用NCBI中BlastP進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守域分析，采用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）軟 件 計算該蛋白分子量及等電點，多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹利用MEGA7.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 基因表達(dá)分析 將所得糜子ASR2的EST序列設(shè)計引物，正向引物為5-′TTGCCTGAACCCTG AAGCAT′-3，反向引物為 5-′AACACCGGACCGAA TTCCTG′-3，各 4 μL（10 mmol/L），根據(jù)蔣曉梅等[23]報道的柳枝稷RT-PCR內(nèi)參基因，篩選出在干旱、鹽、糖脅迫穩(wěn)定度較高的ACT2作為糜子內(nèi)參，引物序列為正向引物5-′GCGAGCTTCCCTGTAGGTA G′-3，反向引物 5-′CGAACCCAGCCTTCACCATAC′-3，RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，經(jīng)調(diào)整合適的cDNA體積，不超過2μL，正向引物和反向引物均為0.6μL，2×SuperReal Color PreMix 10 μL，RNase-free ddH2O補足至20μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性15min；95℃10 s，60℃30 s退火加延伸，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子ASR2基因的克隆

以糜子的第1鏈cDNA為模板，同時設(shè)計了2對引物，并用其上下游引物進(jìn)行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，1，2號引物分別擴增得到432，424 bp長度片段（圖 1）。

將目的片段進(jìn)行純化回收、連接轉(zhuǎn)化、測序獲得序列，所得的序列在DNAMAN軟件進(jìn)行拼接獲得全長541 bp；將所得的序列在NCBI中rpsblast分析得出，這是一種由缺水脅迫引起的植物ABA/WDS誘導(dǎo)蛋白質(zhì)（ASR），該序列包含完整的編碼區(qū)域，命名為 PmASR2（Genebank 登錄號：MH937580），該基因cDNA片段保守域長336 bp，共編碼112個蛋白質(zhì)（圖2），且經(jīng)過DNAMAN軟件親水性和疏水性預(yù)測，該蛋白為親水蛋白（圖3）。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用WoLF PSORT在線軟件進(jìn)行基因亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，PmASR2基因定位在細(xì)胞核內(nèi)；用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測PmASR2所編碼的氨基酸序列蛋白質(zhì)分子量為13 454.92 ku，等電點為11.39，分子式為C581H912N198O172S1，其中，富含谷氨酸和組氨酸等氨基酸。將糜子ASR2氨基酸序列與其他已被發(fā)現(xiàn)的含有ASR基因的8種作物（柳枝稷PUZ47142.1、馬鈴薯 XP_006359804.1、番茄 XP_004237807.1、谷子XP_004952697.1、玉米 XP_008645776.1、高粱 XP_002447825.1、水稻BAD28235.1、短花藥野生稻XP_006647355.1）進(jìn)行多重比較（圖4），可以發(fā)現(xiàn)，這幾個作物的ASR氨基酸序列相似度較高，其中，糜子ASR2基因氨基酸序列與高粱XP_002447825.1最相近，與番茄XP_004237807.1差異最大。

使用NCBI-blast網(wǎng)站上9種植物的cDNA序列，并用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，其cDNA序列相似度較高，在51.2%～86.4%（圖5）。其中，糜子與柳枝稷一致性最高，為86.4%；與番茄一致性最低，為51.2%；與谷子和高粱一致性分別為85.5%和84.0%，而番茄和馬鈴薯ASR基因一致性為76.4%。

2.3 糜子ASR2的表達(dá)分析

2.3.1 在干旱、鹽、糖脅迫下PmASR2基因熒光定量分析 由圖6-A可知，糜子幼苗在PEG脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量在變化情況為根中＞葉片＞莖，莖中幾乎沒有變化。PmASR2基因在根和葉片中相對表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，根中是對照11.6倍，葉片中是對照的3.7倍。糜子幼苗在NaCl脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量在變化情況為根中＞葉片＞莖（圖6-B），在莖中幾乎沒有變化，PmASR2基因根和葉片相對表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，根中是對照16.7倍，葉片中是對照3.6倍。糜子幼苗在甘露醇脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量在變化情況為根中＞葉片＞莖（圖6-C），莖中ASR基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，PmASR2基因根中相對表達(dá)量（0～3 h）逐漸上升在（3～24 h）逐漸下降，且在3 h達(dá)到峰值是對照7.2倍，葉中相對表達(dá)量（0～6 h）逐漸上升在（6～24 h）逐漸下降，且在 6 h達(dá)到峰值是對照的5.1倍。這些結(jié)果表明PmASR2在非生物脅迫干旱、鹽、糖環(huán)境下可能發(fā)揮著重要的作用，其中在干旱和鹽環(huán)境中較為明顯。

2.3.2 在植物激素脅迫下PmASR2基因熒光定量分析 從圖7可以看出，糜子幼苗在ABA激素脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量在變化情況為根＞葉片＞莖，莖中ASR基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，PmASR2基因根中和葉片相對表達(dá)量均在6 h達(dá)到峰值，根中是對照的16.4倍，葉片中是對照的6.8倍；糜子幼苗在GA激素脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量均無明顯變化；糜子幼苗在H2O2激素脅迫下，PmASR2基因相對表達(dá)量的變化情況為根＞葉片＞莖，莖中PmASR2基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，根和葉中PmASR2基因相對表達(dá)量均在6 h達(dá)到峰值，根是對照的3.9倍，葉片是對照的2.5倍；糜子幼苗在IAA激素脅迫下，PmASR2基因相對表達(dá)量的變化情況為根＞葉片＞莖，莖中的PmASR2基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，根中和葉片中PmASR2基因相對表達(dá)量均在6 h達(dá)到峰值，根是對照的7.0倍，葉片是對照的3.8倍。

糜子幼苗在SA激素脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量的變化情況為根＞葉片＞莖，莖中PmASR2基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，根中PmASR2基因相對表達(dá)量在3 h保持較高水平，直至24 h達(dá)到峰值，是對照的9.8倍；葉中PmASR2基因相對表達(dá)量在3 h達(dá)到峰值，是對照的6.5倍。糜子幼苗在MeJa激素脅迫下PmASR2基因相對表達(dá)量的變化情況為根＞莖＞葉，葉和莖中PmASR2基因相對表達(dá)量幾乎沒有變化，根中PmASR2基因相對表達(dá)量0～9 h逐漸上升，在9～24 h逐漸下降，且在9 h達(dá)到峰值，是對照的6.6倍。表明PmASR2基因受許多激素誘導(dǎo)，其中，受ABA，IAA，SA激素誘導(dǎo)較為明顯。

3 討論

ASR蛋白是植物中廣泛存在的一類主要參與植物脅迫應(yīng)答的蛋白，當(dāng)植物遭受逆境（干旱[24]、鹽[25-26]、糖[27]及一些植物激素）脅迫時，ASR基因會被誘導(dǎo)，從而減輕逆境對植物細(xì)胞引起的傷害。

本研究通過查找糜子近源物種柳枝稷ASR基因cDNA，進(jìn)行基因克隆及生物信息學(xué)分析，我們克隆鑒定了PmASR2基因，其全長541 bp，保守域長336bp，共編碼112個氨基酸，該基因包含ABA/WDS保守結(jié)構(gòu)域，對其親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，PmASR2為親水基因，原因可能是由于其蛋白組成富含谷氨酸和組氨酸等親水性氨基酸，這與張會等[28]在厚藤ASR基因里發(fā)現(xiàn)的氨基酸組成相似，猜測糜子ASR基因可能與厚藤ASR基因一樣可以響應(yīng)ABA和非生物脅迫的誘導(dǎo)。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，糜子PmASR2基因在禾本科作物遺傳過程中還非常保守，這與許燦等[29]在枇杷中的研究結(jié)果相似，說明當(dāng)糜子受到干旱脅迫時能促進(jìn)該蛋白合成，從而降低干旱對植物的損害。同時，本研究對糜子PmASR2基因在PEG，NaCl和甘露醇脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該基因在莖和葉中表達(dá)量較高，而在根中表達(dá)量較低，這與桑樹中ASR基因在葉、花、莖中表達(dá)量大于根中的研究結(jié)果一致[30]，隨著時間的延長在 PEG，NaCl，甘露醇處理PmASR2基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。并且根中該基因相對表達(dá)量峰值始終高于葉片中，說明該基因在感受到逆境脅迫時優(yōu)先在根中表達(dá)。FENG等[31]研究發(fā)現(xiàn)，谷子ASR家族在PEG，NaCl，甘露醇脅迫時基因相對表達(dá)量在根和葉中有明顯的增加，在莖中卻開始減少，SiASR3，SiASR4和SiASR6在根中優(yōu)先表達(dá)，說明PmASR2蛋白具有組織特異性和功能特異性。

通過6種植物激素處理發(fā)現(xiàn)，隨著時間增加，ABA，IAA，MeJa，H2O2處理中糜子 PmASR2 基因呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中，ABA，IAA，H2O2脅迫6 h達(dá)到達(dá)峰值，而SA處理3 h就達(dá)到較高的轉(zhuǎn)入水平，并一直保持到24 h，說明該基因受許多植物激素誘導(dǎo)。其中，SA，IAA，H2O2，MeJa能夠輕微地誘導(dǎo)PmASR基因上調(diào)表達(dá)，ABA處理下相對表達(dá)量變化最為明顯，楊曉月等[32]在二穗短柄草中也觀察到相似的研究結(jié)果，說明滲透脅迫誘導(dǎo)PmASR2基因上調(diào)涉及到ABA信號，參與了糜子自身抗逆保護(hù)。

本研究通過對糜子PmASR2基因克隆及生物信息學(xué)分析、熒光定量表達(dá)分析，旨在為進(jìn)一步研究PmASR2基因生物學(xué)功能、明確糜子PmASR2基因?qū)δ婢趁{迫的調(diào)控機制等奠定基礎(chǔ)。