磁珠綁定DNA分子在納米孔中易位研究

邵麗影 陳海洋

摘要：納米孔檢測單個(gè)DNA堿基的挑戰(zhàn)在于DNA通過納米孔的速度過快以至于無法獲得有效的數(shù)據(jù)點(diǎn)。本文通過綁定磁珠來降低DNA的易位速度，DNA分子是通過非共價(jià)鏈霉親和素-生物素鍵連接在磁珠上，并證明在800mV電壓下，被捕獲的DNA與磁珠會(huì)斷裂從而從納米孔中釋放出來。測量綁定磁珠的DNA通過納米孔的阻塞離子電流軌跡，統(tǒng)計(jì)DNA易位事件的持續(xù)時(shí)間。DNA與磁珠綁定后，DNA易位的速度降低。

關(guān)鍵詞：納米孔；DNA；磁珠；過孔時(shí)間

引言

得益于低成本高通量的特性，納米孔檢測技術(shù)廣泛的應(yīng)用于快速分析生物分子（DNA，RNA，蛋白質(zhì)等），以及生物分子之間的相互作用。該技術(shù)通過外加電場驅(qū)動(dòng)待測分子通過納米孔，同時(shí)檢測單個(gè)分子通過納米孔時(shí)引起的離子電流信號(hào)變化來分析單分子的性質(zhì)。納米孔檢測技術(shù)能在一秒鐘內(nèi)獲得上億個(gè)信號(hào)，即不需要標(biāo)記被檢測物，也不需要將分析物錨定在基底上。但是目前該技術(shù)面臨的瓶頸問題在于，待測分子受電場力驅(qū)動(dòng)通過納米孔的速度過快。檢測過程中，難以采集到足夠的電流信號(hào)數(shù)據(jù)點(diǎn)，無法辨識(shí)待測分子細(xì)微的結(jié)構(gòu)特征。例如，DNA分子在200mV電壓驅(qū)動(dòng)下通過固態(tài)納米孔的速度約為30 base/μs[1]。而現(xiàn)有的商品化膜片鉗檢測系統(tǒng)的最大采樣頻率為250kHz，每一次采樣都會(huì)有上百個(gè)堿基通過，因此難以根據(jù)電流信號(hào)的變化分辨出DNA分子上的每一個(gè)堿基分子。針對(duì)這一問題，F(xiàn)ologea等[2]通過調(diào)控偏置電壓、溶液濃度、溫度以及粘度的方式降低DNA分子的過孔速度。但是這一類方法同時(shí)會(huì)導(dǎo)致過孔電流信號(hào)的幅值降低。直接在待測分子施加與電場力相反的力是實(shí)現(xiàn)控制過孔速度的最有效方法。劍橋大學(xué)卡文迪實(shí)驗(yàn)室的Keyser等[3]人最先設(shè)計(jì)并搭建了光鑷裝置，通過在DNA分子上施加機(jī)械力達(dá)到控制其運(yùn)動(dòng)的目的。光鑷能夠控制DNA分子在納米孔中的位置達(dá)到納米級(jí)精度[4]，該方法還擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)覆蓋的DNA分子[12]以及單根RNA分子[5]的操控。但是光鑷系統(tǒng)操控復(fù)雜且只能控制單個(gè)待測分子，喪失了納米孔單分子傳感器相對(duì)于傳統(tǒng)單分子檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)并行檢測的重要優(yōu)勢(shì)。與光鑷相比，磁鑷在理論上可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測分子過孔的并行控制[6]。但是目前仍缺乏將DNA綁定在磁珠上后，DNA分子在納米孔中易位過程的系統(tǒng)研究。

本文通過實(shí)驗(yàn)研究了綁定在磁珠的DNA分子在外加電場驅(qū)動(dòng)下通過在納米孔中的易位過程，觀察到將DNA分子綁定在磁珠上能夠有效降低其過孔速度，并分析了磁珠影響DNA分子的運(yùn)動(dòng)速度機(jī)理，以及在磁珠綁定情況下DNA分子的過孔姿態(tài)。

1 實(shí)驗(yàn)原理和方法

1.1實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理如圖1（a）所示，兩個(gè)充滿溶液的液池通過納米孔相連，將Ag / AgCl電極分別浸入液池中，通過膜片鉗放大器在納米孔兩端施加電壓，從而形成基準(zhǔn)離子電流并驅(qū)動(dòng)DNA分子通過納米孔。當(dāng)DNA分子通過納米孔時(shí)，可利用膜片鉗放大器（AXON 700B）檢測到脈沖離子電流信號(hào)。圖1（a）中，黃色球狀為磁珠，紅色鏈狀為DNA分子。DNA分子通過非共價(jià)鏈霉親和素-生物素鍵連接到磁珠上。本實(shí)驗(yàn)所采用DNA分子為雙鏈lambda DNA（共有48kbp，直徑約2.2nm，長度約16.5μm）；磁珠表面修飾鏈霉親和素（直徑為1.2-1.5μm，購于Sigma公司），其形態(tài)如圖1（b）所示；本文中使用納米孔直徑為33nm；溶液為1 M KCl（pH=8，緩沖液為10mM Tris-HCl，1mM EDTA）；所有實(shí)驗(yàn)均在法拉第籠中完成。

1.2 納米孔的制備

氮化硅納米孔的制備首先采用低壓化學(xué)氣相沉積方法（LP CVD）在硅基底兩側(cè)分別沉積100nm厚的氮化硅薄膜。通過光刻、反應(yīng)離子刻蝕（RIE）工藝在氮化硅表面刻蝕出釋放窗口。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的四甲基氫氧化銨（TMAH）溶液刻蝕釋放窗口露出的硅基地，得到自支撐的氮化硅薄膜。利用聚焦離子束（FIB）減薄局部氮化硅膜的厚度。最后，在減薄區(qū)域利用FIB制備納米孔，納米孔直徑的大小取決于刻蝕的時(shí)間以及離子束束流大小。為了納米孔芯片上的有機(jī)污染物，降低檢測過程中的1/f噪音。制備完成的納米孔用于實(shí)驗(yàn)前需用180℃的食人魚溶液（體積比V（H2S04）：V（H2O2）=3：1）浸泡20min，之后用去離子水清洗。

1.3 磁珠和DNA分子綁定

DNA分子綁定到磁珠之前需將DNA分子生物素化，即將生物素連接到DNA分子的一端。該過程主要包括雜交、提純和將專門設(shè)計(jì)的引物連接到lambda DNA的cos位點(diǎn) [7]。雜交主要運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，它類似于DNA的天然復(fù)制過程。完成雜交后的DNA包含酶和引物等雜質(zhì)，需要提純。DNA提純主要是用苯酚-氯仿法，其原理是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性。最后，在生物素化的DNA溶液中加入5μL的磁珠懸浮液和100mL緩沖液（100mM KCl，10mM Tris-EDTA），在室溫下靜置15分鐘，即完成磁珠和DNA的綁定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

首先，將綁定DNA分子的磁珠加入cis側(cè)液池，施加800mV偏置電壓，檢測到的離子電流信號(hào)如圖3（a）所示，出現(xiàn)了大量下降的脈沖信號(hào)，說明出現(xiàn)了分子過孔事件。由于磁珠的體積遠(yuǎn)大于納米孔，無法通過納米孔，因此綁定在磁珠上的DNA通過納米孔的前提是DNA能夠與磁珠分離。磁珠表面的聚苯乙烯通過共價(jià)鍵與鏈霉親和素連接，DNA通過共價(jià)鍵與單個(gè)生物素分子連接，然后它們通過非共價(jià)鏈霉親和素-生物素鍵連接。因此，DNA分子與磁珠綁定結(jié)構(gòu)中非共價(jià)鏈霉親和素-生物素鍵是最薄弱的一環(huán)[8]。

Merkel等人[9]使用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)鏈霉親和素-生物素鍵的強(qiáng)度進(jìn)行了測試，實(shí)驗(yàn)表明鏈霉親和素-生物素鍵的強(qiáng)度在5～170pN。當(dāng)緩沖液為濃度范圍在0.02～1M的氯化鉀鹽溶液時(shí)，單個(gè)DNA分子上所受到的力與外加電勢(shì)成正比關(guān)系，其中，比例系數(shù)約為0.24±0.02pN mV-1。在本實(shí)驗(yàn)中，電壓為800mV，可以估計(jì)出DNA分子受到的力約為192pN。因此，可以認(rèn)為DNA分子在電場力作用下進(jìn)入納米孔，導(dǎo)致鏈霉親和素-生物素鍵斷裂，掙脫與磁珠的綁定。通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)綁定磁珠的DNA分子平均過孔時(shí)間為24.25 ms，即平均速度為0.68 μm/ms。因此，僅僅將DNA綁定在磁珠上可以有效降低DNA易位過孔的速度約兩個(gè)數(shù)量級(jí)。主要原因兩個(gè)方面。首先，由于磁珠在溶液中無法被電場驅(qū)動(dòng)，DNA分子的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到來自磁珠的反向拖拽力；其次，磁珠的體積遠(yuǎn)大于納米孔，DNA分子只有掙脫與磁珠的綁定才能通過納米孔。

3 結(jié) 論

本文研究分析了自由狀態(tài)的DNA分子以及綁定在磁珠的DNA分子在外加電場驅(qū)動(dòng)下通過在納米孔中的易位過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將DNA綁定在磁珠上可以有效降低DNA易位過孔的速度。

參考文獻(xiàn)

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[8]Peng H，Ling X S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.[J]. Nanotechnology，2009，20（18）：185101.

[9]Merkel R，Nassoy P，Leung A，et al. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.[J]. Nature，1999，397（6714）：50-3.

（作者單位：東南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院）