HLA-G分子在結直腸癌中的表達及意義

何 煦，葉尚勉，董丹丹，李 科

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.中心實驗室，b.病理科，四川 成都 610072)

結直腸癌是目前發病率較高的惡性腫瘤，發生轉移的患者5年生存率不到10%，腫瘤侵襲和轉移是導致食管癌患者死亡的主要因素[1]。隨著診治水平的提高，結直腸癌的發病率在全球范圍內逐步下降，但如何提高結直腸癌的早期診斷率仍是全球性的科研難點和熱點。人類白細胞抗原-G(HLA-G)是一種非經典的HLA-I類抗原，正常情況下HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細胞表達，在分化成熟的正常成人組織中無表達。在病理情況下，HLA-G可以在腫瘤、器官移植和自身免疫性疾病等情況下產生[2]。本研究對HLA-G在結直腸癌患者中的表達進行了分析，并且探討了HLA-G的表達與臨床病理指標之間及生存率之間的關系，為進一步研究HLA-G在結直腸癌發生發展中的作用提供相關的理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2018年1月在四川省人民醫院確診的201例結直腸癌患者，均為首次發現癌癥，且無遺傳性結腸癌綜合征家族史，并且未接受術前化療和放療。男106例，女95例，平均年齡64歲。原發性結腸癌80例，原發性直腸癌121例。臨床病理分期分級按照AJCC 和UICC制定的TNM標準。I期占21% (42/201)，II期38% (77/201)，III期39% (78/201)，IV期2% (4/201)。術后所有Ⅰ～Ⅲ期患者接受口服5-氟尿嘧啶治療，Ⅳ期患者接受包括5-氟尿嘧啶治療的系統治療。85例患者在檢測HLA-G后隨訪，中位隨訪時間27個月(3～36個月)，其中20例患者在隨訪過程中死亡。所有的組織切片取自外科術后病理組織，均為原發性直結腸腺癌，轉移性癌組織未納入，所有病例均為病理診斷結果。

1.2抗HLA-G單克隆抗體(HGY)的制備從人胎盤組織經兩個連續抗體親和層析柱(抗HLA-G抗體親和層析柱和抗HLA-Gβ2微球蛋白抗體親和層析柱)分離純化獲得天然HLA-G蛋白。然后用天然HLA-G蛋白按標準方法免疫BALA/C小鼠。再用免疫小鼠的脾細胞與SP2鼠骨髓瘤細胞株融合成雜交瘤細胞。經用有限稀釋法，抗體捕獲酶聯免疫測定法和Western blot等方法篩選出一株分泌抗HLA-G單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為HGY。該細胞株產生的單克隆經小鼠抗體分型試劑盒確定為IgG3。實驗還進一步證明該抗體結合位點在HLA-G的α1區域。

1.3免疫組織化學檢測用免疫組織化學SP法檢測結直腸癌組織中HLA-G的表達，通用型SP試劑盒購自北京中杉金橋公司，抗HLA-G蛋白單克隆抗體的工作濃度為1∶400。組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，常規脫蠟水化，抗原修復，封閉內源性過氧化物酶，加一抗HGY 4 ℃過夜。PBS緩沖液洗3次，加S-P試劑盒，鏡下顯色后，用蘇木精對比染色。每次實驗都設陽性對照和陰性對照。以癌細胞膜，細胞漿，細胞核出現棕黃色反應物判為陽性表達，由兩位病理學專家在光鏡下判讀結果，根據顯色百分比和顯色信號的強度，將顯色結果分為四級：(-)組織標本無染色；(+)陽性信號少于25%的癌癥組織，和/或顯色信號弱；(++)陽性信號在25%～50%，和/或信號強度中等；(+++)陽性信號多于50%，和/或顯色為強陽性。

1.4宿主免疫反應評估采用結直腸癌患者腫瘤內淋巴細胞的浸潤數量評估宿主的免疫反應。在5個高倍視野下，計數浸潤的淋巴細胞數目，根據淋巴細胞的數量，將宿主免疫反應評分為強(+++)、中(++)、弱(+)。

1.5統計學方法采用SPSS 17.0統計學軟件處理數據。計數資料比較采用χ2檢驗，生存率的分析采用Kaplan-Meier法。建立Cox回歸模型進行多因素分析，確定影響生存率的獨立預測因素，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1原發性結直腸癌中HLA-G表達原發性結直腸癌組織中，65%(130/201)出現HLA-G表達，其中18%(24/130)為強表達(+++)，31%(41/130)為中度表達(++)，50%(65/130)為弱表達(+)。HLA-G的表達部位在細胞膜(8%)或胞漿中(2%)，兩個部位同時表達最多見(90%)，71例結直腸癌標本(35%)未見HLA-G表達。正常結直腸組織和良性腺瘤組織中未見HLA-G表達。見圖1。

圖1 結直腸癌和正常結直腸組織中HLA-G的表達(×200) a：結直腸癌HLA-G表達強陽性；b：正常結直腸組織中無HLA-G表達

2.2不同臨床病理學參數間HLA-G的表達HLA-G的表達在腫瘤部位、腸壁浸潤深度、淋巴結轉移和疾病分期方面的差異有統計學意義(P< 0.05)，在年齡、性別、組織分化程度上差異無統計學意義(P> 0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理學參數間HLA-G的表達

2.3HLA-G在結直腸癌的表達與宿主免疫反應的關系從圖2可以看出，HLA-G表達強陽性的區域淋巴細胞少，而HLA-G表達陰性的區域有大量淋巴細胞浸潤。HLA-G表達陽性與HLA-G表達陰性的腫瘤組織相比，淋巴細胞的浸潤被明顯抑制，差異有統計學意義(χ2=42.677，P< 0.001)，見表3。

圖2 HLA-G的表達與宿主免疫反應的關系(×200) a：HLA-G表達強陽性的區域淋巴細胞少；b：HLA-G表達弱陽性的區域大量淋巴細胞浸潤；c：HLA-G陰性區域大量淋巴細胞浸潤

宿主免疫反應病例數HLA-G 表達(-)(+)(++)(+++)P弱9717302822中等 54261882強502817500.001

2.4HLA-G在結直腸癌的表達與患者生存率之間的關系85例患者在36個月隨訪期間，20例患者因腫瘤發生死亡，其中48例HLA-G陰性患者中2例死亡，37例HLA-G陽性患者中18例死亡，HLA-G陰性患者的生存率(96%)明顯高于HLA-G陽性患者(51%)(χ2=22.98，P= 0.001)。分析其它臨床病理學因素，如年齡、性別、浸潤深度、組織分化程度、淋巴結有無轉移、疾病分期與患者生存率之間的關系，其中淋巴結有無轉移和疾病分期與生存率有關(表4)。Cox多因素分析確定HLA-G的表達與TNM分期、淋巴結有無轉移一樣，也是結直腸癌一個獨立的預后指標(P= 0.021)，見表5。

表4 生存率與各種臨床病理學參數的關系

表5 結直腸癌患者生存率的影響因素分析

3 討論

HLA-G是一種非經典的HLA-I類抗原，該白細胞抗原的基因同經典I類白細胞抗原的基因都位于第6對染色體的短臂上，基因和表達的產物與經典I類白細胞抗原有86%雷同[3]。在正常生理情況下，HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細胞和其他少量的組織，如胸腺，角膜和骨髓造血祖細胞等表達(HLA-A，-B 和-C在幾乎所有的有核體細胞均有表達)，在母體對胎兒的免疫耐受起重要作用，在妊娠時可以保護胎兒免受母親免疫系統的排斥[4]。HLA-G具有抑制自然殺傷細胞 (NK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和抗原遞呈細胞(APC)的功能，是機體免疫耐受機制中重要的調節因子[5，6]。

近年來的研究發現，HLA-G在大多數常見惡性腫瘤組織又重新出現表達，HLA-G在腫瘤細胞的表達具有較高的腫瘤特異性[7～9]。本實驗201例結直腸癌的研究數據表明，有較高比例的患者(65%)出現HLA-G蛋白的表達，而在正常結直腸組織則無表達。在分析了結直腸癌患者HLA-G的表達與各項臨床病理學參數的關系后發現，HLA-G的表達與組織分化程度、腸壁浸潤深度、疾病分期有關，這些結果提示HLA-G的免疫組織化學檢測可作為判斷結直腸癌的一個輔助診斷指標。

腫瘤在發生和發展變化過程中，要表達一些不同于正常組織的腫瘤抗原，免疫系統對這些發生癌變的細胞有排斥消除的功能，稱之宿主的免疫監視。但在已經患上癌癥患者的體內，癌細胞明顯地逃過了宿主的免疫監視，這種現象稱之為腫瘤的免疫逃逸[10，11]。由于HLA-G是一種免疫抑制分子，能夠抑制免疫應答，可引起腫瘤細胞的入侵和轉移，因此如果腫瘤細胞出現HLA-G的異常表達，便能更好地解釋腫瘤免疫逃逸機制。在研究HLA-G的表達與宿主免疫反應的關系中我們發現，HLA-G的表達與宿主免疫反應成負相關關系，HLA-G表達陽性的區域宿主免疫反應弱于HLA-G陰性區域，說明HLA-G可能參與了宿主的免疫反應，是腫瘤細胞逃避宿主免疫反應的策略之一。此外，HLA-G的表達與結直腸癌的預后密切相關，HLA-G陰性患者的生存率明顯高于HLA-G陽性患者，也表明HLA-G可通過抑制宿主免疫反應，幫助腫瘤細胞逃避宿主的免疫應答，使腫瘤易于發生轉移，從而使患者生存率降低。

綜上，本研究比較了HLA-G在結直腸癌和正常結直腸組織中表達的差別，以及與各項臨床病理指標的關系，并且同時分析了與生存率之間的關系，通過以上結果表明，HLA-G分子在結直腸癌的發生、發展、轉移、預后中都有重要作用，它參與了腫瘤免疫逃逸機制。HLA-G在惡性腫瘤的表達可能具有較高的臨床應用價值，能夠用于腫瘤的診斷和預后的指導和監測，是一個較為理想的腫瘤標志物。