鎮肝熄風湯對SHR大鼠Ang II 1型受體蛋白和mRNA表達的影響

謝 鑫，陳 磊，苗嘉芮，吳成舉，劉文俊，陳 靖，張立德

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學杏林學院，遼寧 沈陽 110032)

現代生活壓力以及國際化進程，造成精神壓力過大，很多原發性高血壓患者臨床表現為：肝陽上逆、肝陽亢逆無所制，氣火上擾，從而引起頭目脹痛，急躁易怒，心悸健忘，面紅目赤等癥狀。這些癥狀屬于肝陽上亢型高血壓，需要“鎮肝息風，滋陰潛陽”對癥治療。鎮肝熄風湯摘錄于《醫學衷中參西錄》，用于治療肝陽上亢，氣血上逆證型自發性高血壓，具有顯著的降低血壓療效。血管結構變化是高血壓疾病的重要改變。血管緊張素原(Angiotensin，Ang)是一種肽類物質，具有血管收縮功能，同時刺激腎上腺皮質分泌醛固酮的功能，醛固酮促進遠曲小管和集合管上皮細胞Na+重吸收和排放K+，促進體內Na+和水的儲留[1～3]。體內血管內容量血液增多以及強烈的血管收縮，導致血壓升高。Ang有七個亞型，分別為AngⅠ、AngII、AngIII、AngⅣ、AngⅤ、AngⅥ、AngⅦ，其中Ang II具有收縮血管功能作用，是血管緊張素家族中作用最強的分子因子；而Ang II 1型受體(Angiotensin II Type 1 Receptor，AT1R)是Ang II產生血管收縮功能最重要的受體[4，5]。本實驗采用自發性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)，用中醫經典古方鎮肝熄風湯，來觀察對SHR大鼠的腹主動脈AT1R蛋白表達和AT1R mRNA表達的影響，揭示鎮肝熄風湯對肝陽上亢型SHR大鼠降低血壓的生物學機制。

1 材料與方法

1.1動物2016年3月至2017年12月，選擇SPF級別 SHR大鼠 60 只，健康雄性 24 周齡；12只 SPF 級別，雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)，體重量為：(200±15)g，實驗動物許可證號為：SCXK(京)2016-0011，采購于北京維通利華實驗動物技術有限公司；大鼠飼養條件為：室溫 21-26 ℃，相對濕度 46%～56%。采用隨機數字表方法將SHR大鼠分成 5 組各12只：模型組、鎮肝熄風湯低劑量組、鎮肝熄風湯中劑量組，鎮肝熄風湯高劑量組；復方羅布麻組；12 只WKY大鼠(健康同源雄性)作為正常組。

1.2藥物與試劑鎮肝熄風湯：生代赭石30g(先煎)、甘草5 g、黃芩15 g、牛膝30 g、生牡蠣15 g(先煎)、川芎15 g、生地15 g、梔子15 g、白芍20 g、生龍骨15 g(先煎)、玄參15 g、炙龜板15 g(先煎)、丹參20 g、白術10 g、鉤藤15 g、茯苓10 g等；遼寧中醫大學附屬醫院藥店采購實驗中所用的中藥藥材(產地山東)，由張林老師(遼寧中醫藥大學基礎醫學院方劑教研室)鑒定：中藥藥材均為合格正品；常規煎煮水提中藥藥材，每副中藥加水8倍量約為：1400 mL，中藥浸泡時間為：30 min，其中生牡蠣、炙龜板、代赭石、生龍骨先煎為：30 min，再加入鎮肝熄風湯藥方中其余的中藥藥材，再次煎煮時間為：30 min；中藥煎好后，用無菌紗布(10 層)過濾，收集中藥藥液。一抗兔抗大鼠AT1R抗體(美國Abcam company公司)；二抗羊抗兔辣根過氧化物酶標記(Horse Reddish Peroxidase，HRP；日本TaKaRa公司)；復發羅布麻片I(國藥準字：14022937，亞寶藥業集團股份有限公司)；AT1R引物：上游5’-TCAACCTCTACGCCAGTG-3’，下游 5’e-CAAGCCAGCCATCAGC-3’，GAPDH引物：上游5’-TCGGACGCCTGGTTAC-3’，下游5’-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3’，RT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa；批號：RR014 A)；實時定量試劑盒(日本TaKaRa；批號：RR014 A)；PCR擴增儀(美國ABI 公司；型號：9700)；核糖核酸提取試劑盒(美國Abcam company公司，貨號：15596026)。

1.3給藥方法按照人體和大鼠體表面積比換算[6]，SHR大鼠給藥等效劑量為：SHR大鼠藥物劑量=X mg/kg×70 kg×0.018/200 g=X mg/kg × 70 kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg，鎮肝熄風湯低劑量組、中劑量組和高劑量組用藥劑量分別為：18 g/kg、40 g/kg和80 g/kg，根據公式換算成中藥濃度為：1 g/ml/2 g/ml，4 g/ml，復方羅布麻片懸浮液組為：80 g/kg，根據公式換算成中藥濃度為：0.02 g/ml，4 ml/d。給予每只大鼠灌胃模型對照組給予0.9% 氯化鈉溶液、小劑量組給予鎮肝熄風湯 18 g/kg、中劑量組給予鎮肝熄風湯 40 g/kg，高劑量組給予鎮肝熄風湯80 g/kg；陽性對照組給予 80 g/kg；正常對照組給予0.9% NaCl 溶液。連續灌胃給藥45天，早晚各一次。

1.4WesternBlotting檢測每組大鼠取1～2 cm標本(主動脈弓下段的腹主動脈)，每個樣本使用PBS(美國Thermofisher公司，產品號：10010031)沖洗，沖洗后，總蛋白裂解液(美國Thermofisher公司，產品號：78510)加入每個樣本中，使用勻漿機進行組織勻漿(操作均在冰塊中進行)；每個樣本總蛋白定量：使用牛血清蛋白(酚試劑方法)：在波長為650 nm條件下，測得每個樣本的OD值(722分光光度計)；根據每個樣本的OD值，把每個標本配成相同體積和相同濃度；把Running Buffer(美國Thermofisher公司，產品號：NP0001)加入所有的標本中，在100 ℃沸水中，使每個樣本中的蛋白變性(煮沸時間為：5 min)；每個樣本加樣進行跑膠(分離膠和濃縮膠跑膠)；取出跑完的膠，將膠體放入轉印槽中進行轉印(將變性的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上)；轉印完畢后，取出轉印膜(硝酸纖維素膜)，2 h(5%，伊利脫脂奶粉)封閉轉印膜，封閉后使用TTBS(美國invitrogen公司，產品號：9404)進行清洗(2次，每次5 min)，清洗后轉印膜中加入1：1000稀釋的一抗(美國Abcam company公司)，再加入1：350稀釋的二抗(日本TaKaRa公司)，把加入一抗和二抗后的轉印膜放入平皿中，使用TTBS(美國invitrogen公司，產品號：9404)進行沖洗(2次，每次5 min)，沖洗后的轉印膜，按說明書操作進行ECL發光檢查每個樣本中的AT1R蛋白含量。

1.5RealTimeRT-PCR測定所有的標本加入TRIzol(美國Abcam company公司，貨號：15596026)試劑，室溫放置5 min，使每個樣本充分裂解釋放總RNA，提取總RNA后，使用勻漿機進行組織勻漿(操作均在冰塊中進行)，勻漿后，每個樣本加入200 μl氯仿/ml(美國Amresco公司)，使用4 ℃超速離心機(美國Beckman公司，型號：L-80XP)：12000×g，離心15 min，吸取每個樣本的上清液(棄沉淀)，加入0.5 ml異丙醇/ml(美國Amresco公司)搖勻；搖勻后，使用4 ℃超速離心機：12000×g，離心15 min，棄每個樣本EP管的上清，提取的總RNA沉于EP管底部；加入75% 1 ml乙醇/ml，進行搖勻，使用4 ℃超速離心機：12000×g，離心15 min，再次棄掉每個樣本EP管中的上清液；Nuclease free water(美國Abcam company公司，貨號：AM9937)試劑加入每個樣本中。260 nm、280 nm波長測定每個樣本的OD值(紫外可見光分光光度計)；測定后，根據測定每個樣本的OD值，把每個樣本配成相同體積和相同濃度，按說明書操作加入RT-PCR(日本TaKaRa；批號：RR014 A)試劑盒中的試劑，使每個樣本中提出的mRNA逆轉錄合成cDNA，再加入Real-time PCR(日本TaKaRa；批號：RR014 A)試劑盒中的試劑，按說試劑盒中的明書，進行樣本的實時定量PCR 擴增操作。

1.6統計學方法實驗數據使用SPSS 13.0 統計軟件分析，選用ONE WAY ANOVA方法進行統計學分析結果，以均數±標準差表示各組數據。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1WesternBlotting結果與模型組比較，正常對照組、鎮肝熄風湯中劑量、高劑量和復方羅布麻組中AT1R蛋白表達明顯降低(F=863.465，P< 0.01)。見圖1，圖2。

圖1 AT1R 和GAPDH 蛋白表達

圖2 AT1R/GAPDH 灰度值比較 *與模型組比較，P < 0.01 A：正常對照組；B：模型組；C：鎮肝熄風湯低劑量組；D：鎮肝熄風湯中劑量組；E：鎮肝熄風湯高劑量組；F：復方羅布麻組

2.2RealTimeRT-PCR結果與模型組比較，正常對照組、鎮肝熄風湯中劑量高劑量和復方羅布麻組中AT1R mRNA的表達明顯降低(F=863.465，P< 0.01)。見圖3。

圖3 AT1R/GAPDH mRNA擴增比值 *與模型組比較，P < 0.01 A：正常對照組；B：模型組；C：鎮肝熄風湯低劑量組；D：鎮肝熄風湯中劑量組；E：鎮肝熄風湯高劑量組；F：復方羅布麻組

3 討論

現代快速生活節奏，造成高血壓疾病的患者日益增多，其中高血壓疾病分為兩種：原發性高血壓和.繼發性高血壓，原發性高血壓占高血壓疾病的90%以上[7～9]。血壓升高最起始影響的原因是血管收縮的改變，血管收縮最重要的影響因子是Ang II，引起Ang II收縮血管生物學效應的最重要的受體是AT1R，大量實驗研究表明，Ang II與AT1R結合，產生強烈的血管收縮效應[10～12]。Ang II與AT1R結合后，使AT1R活化后，通過激活磷脂酶C和增加細胞內Ca+濃度，引起強烈的收縮血管作用，同時刺激醛固酮合成和分泌，增加體內的Na+和水的儲留，有效的提高體內的循環血量，進一步的提高收縮血管帶來的高血壓的生物學效應[13～16]。

鎮肝熄風湯出自《醫學衷中西參錄》，其藥方成分作用：牛膝生代赭石相伍，剛柔并進，重用牛膝，將隨風上逆的血引而下行；生代赭石色赤而入血，石體質重而下行，平定上逆之挾血肝風；牡蠣、龍骨和龜板合用，具有滋陰潛陽的作用；牡蠣為水中之物，入藥將浮越之陽潛降于水中[17]。經典中藥方鎮肝熄風湯是具有“鎮肝熄風，滋陰潛陽”的功效，顯著有效的治療肝陽上亢型自發性高血壓，改善頭目眩暈、目脹耳鳴、心中煩熱、脈弦長有力、肢體漸覺不利、眩暈、精神萎靡等臨床癥狀。

鎮肝熄風湯可以調低SHR大鼠腹主動脈血管組織中AT1R蛋白表達和AT1R mRNA 表達，減少SHR大鼠的血管收縮能力，起到有效降低SHR大鼠血壓作用。