靈芝原生質體單核菌株的制備及形態特性比較

叢倩倩 崔 曉 王慶武

（泰安市農業科學研究院，山東泰安271000）

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種珍貴的藥用真菌，含有多糖、三萜等多種有效活性成分，具有抗腫瘤、護肝、提高免疫力、美容養生、延年益壽等多種功效，是一種理想的保健食品[1-2]。

近年來，我國靈芝栽培、深加工業得到迅速發展，市場規模逐步擴大，靈芝產業已成為我國最重要的食藥用菌產業，因此靈芝優良品種的選育尤為重要。雜交育種是食用菌新品種選育中使用最廣、收效最顯著的手段，其基本育種材料是單核體。單核體常規的是從擔孢子中分離單個孢子獲得，但是靈芝孢子人工條件下很難萌發，無法通過常規的單孢分離技術進行雜交育種。1989年，Peberdy在研究絲狀真菌原生質體制備和再生時，發現菌絲體的原生質體中含有三種類型，即無核、單核、雙核原生質體[3]。隨后，潘迎捷等發現單核原生質體是異宗結合食用菌原生質體中的一個普遍現象[4]，利用這一現象可以從菌絲體中直接得到單核體，而不受出菇和孢子的限制[5]。因此可以通過原生質體單核化來獲得靈芝雜交育種材料。

研究以3個靈芝菌株為供試材料，分別制備其原生質體，并從中篩選單核菌株，比較單核與雙核、不同交配型單核菌株之間的生長特性，以期為今后靈芝單核雜交育種提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

靈芝菌株為泰山赤靈芝1號、靈芝4895、野生靈芝2，均由泰安市農業科學研究院食用菌所保存。

液體（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g。加水1 L，pH自然。液體再生培養基：麥芽糖5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，甘露醇0.6 mol/L。加水1 L，pH自然。

穩滲劑：0.6 mol/L甘露醇。溶壁酶：購自廣東微生物研究所，用0.6 mol/L甘露醇配成2%濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 原生質體的制備與再生

分別取供試菌株的原種菌塊接入含有100 mL液體PDA培養基的250 mL三角瓶中，于25℃培養箱中靜置培養7 d。菌液9600×g離心15 min，去上清，

菌絲用無菌水洗滌一次，濾紙吸干菌絲水分。稱取0.5 g菌絲于5 mL離心管中，加入2 mL 2%的溶壁酶，30℃水浴2.5 h，濾去殘留菌絲，0.6 mol/L甘露醇清洗2次，離心收集原生質體，用液體再生培養基適當稀釋后涂布于固體再生培養基平板上，25℃靜置培養72 h至長出再生菌落。

1.2.2 單核菌株的篩選

從供試菌株原生質體再生平板上挑取菌落小，生長比較緩慢的單菌落分別轉接到PDA試管斜面培養基上，待菌絲長出后挑取少量菌絲鏡檢，無鎖狀聯合的為單核再生菌株。

1.2.3 單核菌株交配型的確定

圖1 單核菌株與其出發菌株的宏觀菌落形態

每種供試菌株得到的原生質體單核菌株應具有兩種不同的交配型。分別隨機選取一株已經鑒定的單核菌株作為標準，然后將每種供試菌株的其他單核菌株分別與這一標準菌株進行配對，配對時，兩菌株各取5 mm菌塊接種于PDA平板上，相距約2 cm，大約7 d后在菌絲交接處挑取菌絲鏡檢，有鎖狀聯合的證明兩菌株為不同的交配型；無鎖狀聯合的證明兩菌株為相同的交配型。

1.2.4 單核菌株生長情況的測定

采用平板培養菌絲體，25℃恒溫培養箱暗培養，“十字交叉”法測量菌落直徑，計算菌絲長速并觀察記錄菌絲長勢。

1.2.5 單核菌株微觀形態觀察

用載玻片刮取培養皿邊緣菌絲制成玻片標本，在光學顯微鏡下先用10倍物鏡找到目標，然后用40倍物鏡對不同交配型單核菌絲進行形態觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 三個靈芝菌株單核菌株的得率

三個靈芝菌株原生質體單核化菌株得率見表1。由表1可以看出，TL-1單核得率最高為52.5%，其次4895為38.3%，YSL-2單核得率最低為5%。說明不同靈芝菌株單核菌株的得率是不同的，TL-1獲得單核菌株的概率較高，YSL-2則較低。

表1 三個靈芝菌株單核菌株的得率及兩種交配型比例

2.2 三個靈芝菌株原生質體單核菌株交配型測定

三個靈芝菌株原生質體單核菌株交配型測定結果見表1。TL-1獲得了兩種交配型的單核菌株，分別命名為TL-1-DH1和TL-1-DH2，兩種交配型數量之比為16∶5，而4895、YSL-2均只獲得了一種交配型，分別命名為4895-DH、YSL-2-DH，說明不同靈芝菌株兩種交配型單核菌株的獲得比例不同，TL-1比其他兩個菌株較易獲得兩種交配型單核體。4895和YSL-2的其中一種交配型單核菌株相對較易獲得，而另一種交配型單核菌株不易得到。此外還可以看出，三個菌株兩種交配型單核體的分離比例均不符合1∶1的理論值。

2.3 單核菌株與其出發菌株以及不同單核菌株之間的形態特征比較

單核菌株與其出發菌株以及不同單核菌株之間的宏觀、微觀形態特征見圖1、圖2和表2。

由圖1可以看出，不同單核菌株之間以及不同單核菌株與出發菌株之間菌絲長速以及菌落形態均表現出明顯的差異。4種單核菌株在菌絲生長速度上與其出發菌株比，均表現出生長速度變慢的現象，且同一菌株具有兩種不同交配型的單核菌株生長速度以及菌落形態也存在差異。TL-1-DH1和TL-1-DH2單核菌株其出發菌株均為TL-1，但TL-1-DH1菌絲濃密厚薄均一，邊緣不整齊，長速為0.87 cm/d；TL-1-DH2的菌落中間較濃密，邊緣較稀薄整齊，厚薄不一，長速為0.95 cm/d，快于TL-1-DH1，也快于4895-DH和YSL-2-DH；4895-DH氣生菌絲較多，菌落中間較濃密，邊緣不整齊，長速最慢為0.69 cm/d；YSL-2-DH菌絲濃密，邊緣整齊且厚薄均一。

圖2 四種不同交配型單核菌株菌絲的微觀形態（400×）

表2 三個靈芝菌株不同交配型單核菌株菌落形態特征比較

不同交配型的單核菌絲體的微觀形態見圖2。由圖2可以看出在光學顯微鏡下觀察不同交配型單核菌絲體的形態也表現出明顯的差異。YSL-2-DH菌絲比較密集；TL-1-DH1和TL-1-DH2菌絲生長比較規則，分支少；4895-DH菌絲生長凌亂、分支較多。

3 小結與討論

一般來說，單核菌絲的生長速度比雙核菌絲慢，在再生培養基中要盡量挑取菌落較小、生長比較緩慢的單菌落。在三個靈芝菌株原生質體再生平板上，分別挑取菌落較小、生長較慢的單菌落，均獲得了單核體菌株，但是4895、YSL-2均只獲得了一種交配型單核體，如果進一步加大原生質體的再生數和挑取菌落數可能會篩選到另一種交配型的單核體。

試驗獲得了TL-1兩種交配型單核體，分離比例為16∶5，4895、YSL-2均只獲得了一種交配型單核體，三個靈芝菌株兩種交配型單核體的分離比例均不符合1∶1的理論值，這與吳小平、朱朝輝等的報道類似[6-7]，分析原因可能是因為兩種交配型單核體的再生速度和再生能力不同，一種交配型單核體的再生速度較快、再生能力較強，在再生前期出現的菌落中出現，因此較易獲得；而另一種單核體再生速度較慢、再生力較弱，在再生后期出現的菌落中由于雙核菌絲的迅速生長，覆蓋了再生的單核體，因此不容易挑取到。

研究中四種單核菌株的生長情況、宏觀、微觀菌落形態均表現出一定程度的差異，這為以后雜交育種親本的選擇提供了理論指導，但是單核菌株生長情況的好壞與其雜交后代農藝性狀的好壞并不是成正相關的，單核菌株生長狀況弱的，其雜交后代的農藝性狀并不一定差，單核菌株生長較好的，其雜交后代的農藝性狀也不一定優良，所以在以后的研究中要把這些單核菌株都作為雜交育種的材料，兩兩均配對雜交以增加獲得優良菌株的機會。