免疫細胞亞群與多發性骨髓瘤臨床預后因子相關性研究

魏文波，杜 宇

(樂山市武警四川總隊醫院檢驗科，四川 樂山 614000)

多發性骨髓瘤(MM)是一種惡性漿細胞腫瘤，細胞癌變起源于骨髓中的漿細胞。由于淋巴細胞出現免疫功能異常，致使細胞監視功能缺陷，免疫系統對于惡變的腫瘤細胞進行清除的能力下降，從而發生并發展為MM[1]。MM患者的免疫系統存在復雜的缺陷，包含DC、NK細胞、B細胞、T細胞等多個方面，這些方面可能共同參與了惡變的腫瘤細胞的免疫逃逸機制[2，3]。MM患者的生存期差異較大，尋找腫瘤臨床預后因素的工作難度較大。MM常并發高鈣血癥、腎臟損害及貧血等，由于患者正常免疫球蛋白的生成受到抑制，容易出現細菌性感染[4]。本研究探討免疫功能缺陷與MM危險分層以及臨床預后因素的關系，為進一步研究MM的發病機制以及免疫治療方案提供參考。

1 資料及方法

1.1一般資料2016年4月到2018年3月我院收治的32例MM患者，年齡46～77歲[(53.14±5.48)歲]，患者均為初診；采用國際分期系統(DS)進行疾病分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，行淋巴細胞表型分析后發現患者未出現活動性感染。化療后患者病情有24例處于穩定期，8例進展期，將患者按照年齡分組，45～60歲18例為一組，61歲以上14例為二組。32例患者與104例健康獻血者進行對比，一組62例，二組42例。

1.2診斷標準[5]①患者骨髓中漿細胞增多數量>30%；②骨髓漿細胞異常增生10%～30%，活檢證實為漿細胞腫瘤；③M蛋白過度產生，尿本周蛋白成分>1 g/24 h；血清IgA>20 g/L，IgG>35 g/L；④正常免疫球蛋白減少，IgA<1 g/L，IgG<6 g/L，IgM<0.5 g/L。

1.3分期標準[6]①Ⅰ期患者骨髓瘤細胞總數<0.6×1012/m2，血鈣正常，骨骼X射線結果正常，或者呈現孤立性溶骨病變，血紅蛋白>100 g/L，M蛋白IgA<30 g/L 、IgG<30 g/L；②Ⅱ期患者骨髓瘤細胞總數<(0.6～1.2)×1012/m2，；③Ⅲ期患者骨髓瘤細胞總數>1.2×1012/m2，血鈣>2.99 mmol/L，骨骼X射線呈現進行性溶骨病變，血紅蛋白<85 g/L，M蛋白IgA>50 g/L 、IgG>65 g/L。

1.4研究方法①淋巴細胞亞群檢測：使用流式細胞儀對患者的淋巴細胞免疫表型進行檢測，方法參照文獻[7]：取出兩組患者以及健康獻血員新鮮的抗凝血標本各4 ml，用于血常規檢測2 ml，另2 ml用于流式細胞儀(美國BD Bioscience生產，型號BD FACSEALIBUR)進行熒光抗體標記測驗。檢測過程中使用的單克隆抗體組成為：FITC-IgG1/PE-IgG1/PEcy5-IgG1、FITC-CD3/PE-CD16/PEcy5-CD19、FITC-CD3/PE-CD8/PEcy5-CD4、FITC-CD28/PE-CD81/PEcy5-CD4等。取標本中各100 μl放入指定樣品測定管內，并加入相應熒光標記的單克隆抗體，振蕩混勻、避光孵育，室溫下靜置20分鐘后加入500 μl溶血素，同樣振蕩混勻、避光孵育，室溫下靜置8分鐘。溶血完成后，在測定管內加入2 ml磷酸緩沖液，沖洗兩遍后加入1 ml磷酸緩沖液混勻后上機檢驗。②脊髓染色體熒光原位雜交檢測：采用熒光原位雜交技術來進行檢測，方法參照文獻[8]：取兩組患者新鮮的抗凝骨髓液標本各4 ml，從中提取單個核細胞，對其進行低滲、固定處理，于-80 ℃環境中保存。雜交檢測前一天滴片，室溫下老化，第二天放置顯微鏡下觀察，劃定雜交范圍。檢測5種細胞的細胞遺傳學異常，包含1q21擴增、D13 s319缺失、RB1缺失、P53缺失以及IGH易位。細胞遺傳學異常陽性：異常信號>10%。③血清β2-MG的檢測：采集MM患者空腹外周血5 ml，采用免疫比濁法檢測血清β2-MG水平，儀器為OLYMPUS AU2700型的全自動生化分析儀。

1.5統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。非正態分布計量資料比較采用Wilcoxon檢驗，正態分布計量資料比較采用t檢驗；相關性分析采用Person直線相關法。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MM患者淋巴細胞亞群分析與對照組比較，不同年齡段的兩組患者CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比明顯升高(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比明顯降低(P< 0.05)。見表1。

2.2細胞遺傳學異常對MM患者淋巴細胞亞群的影響32例MM患者中有28例進行了脊髓染色體熒光原位雜交檢測，本研究將高危遺傳學改變定義為1q21擴增呈現陽性，P53缺失陽性及3個以上的染色體異常。將28例患者劃分為高危細胞遺傳學(FISH高危組)與無高危細胞遺傳學(FISH無高危組)，分別為13例、15例。兩組T淋巴細胞比例及絕對值比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。FISH高危組CD8+細胞比例、CD8+HLADR+/CD8+細胞比例明顯高于FISH無高危組，CD4+CD28+/CD4+百分數明顯低于FISH無高危組(P< 0.05)。見表2。

2.3MM患者淋巴細胞亞群與β2-MG的關系CD8+細胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比與血清β2-MG水平呈正相關(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比與β2-MG呈負相關(P< 0.05)，見表3。

表1 兩組MM患者淋巴細胞亞群分析結果

表2 熒光原位雜交技術不同程度分層亞組患者的淋巴細胞亞群比較

表3 MM患者淋巴細胞亞群與生化指標的關系

3 討論

MM是一種源自B淋巴細胞的惡性漿細胞疾病，作為B淋巴細胞發育到最終階段的細胞，MM病癥可以歸類在B淋巴細胞的范圍之中[9，10]。MM臨床上主要表現為骨髓漿細胞的異常增生，伴有單克隆免疫球蛋白或者M蛋白過度產生。MM患者除了體液免疫功能缺陷外，細胞免疫功能也存在諸多異常[10～12]。T細胞在人體內不斷更新，同一時間中能夠存在不同的發育階段或者功能，其中可將T細胞分為若干亞群，主要有：①輔助性T細胞，如Th(CD4+)細胞，主要能夠輔助體液免疫、細胞免疫；②抑制性T細胞，如Ts細胞(CD3+/CD8+)，能夠抑制細胞免疫、體液免疫；③效應T細胞，能夠釋放淋巴因子功能；④記憶T細胞，如CD4+細胞記憶亞群，能夠記憶特異性抗原刺激等等。

有研究對MM患者淋巴細胞亞群分析，發現MM患者體內B細胞、NK細胞以及T細胞水平異常，由于年齡是影響MM患者生存期的危險因素，研究發現年齡>60歲患者中位生存時間顯著短于年齡≤60歲患者[13]，所以本研究根據患者年齡分為45～60歲組和60歲以上組，并對兩組與健康對照組淋巴細胞亞群進行分析。結果發現，45～60歲組CD4+細胞百分比顯著升高，CD8+細胞百分比無明顯變化，CD4/CD8比值明顯升高，60歲以上組CD4+細胞百分比、CD4/CD8比值均無明顯變化，CD8+細胞百分比明顯升高，與之前研究結果不一致[14]。原因可能在與T細胞亞群構成復雜有關。CD4+T細胞可分為作用完全相反的不同亞群，如CD4+Th1和Th2細胞可使機體免疫功能增強，而Tregs細胞對機體免疫功能具有抑制作用，同樣CD8+T細胞也可分為抑制性T細胞和細胞毒性T細胞，所以對CD4+T細胞和CD8+T細胞總體情況進行分析意義不大，需進一步細化分析。

CD4+CD28+/CD4+細胞百分比可反映CD4+T細胞功能，因為外周血T細胞增殖、分泌細胞因子除了需要MHC的呈遞信號外，還需B7分子與T細胞上的CD28結合所提供的信號[12]。本研究發現，兩個年齡組相對于對照組，CD4+CD28+/CD4+百分比均顯著降低，FISH高危組相對于FISH無高危組，CD4+CD28+/CD4+百分比顯著降低，提示MM患者免疫功能存在異常，CD28表達減少，無法被抗原呈遞細胞激活產生細胞因子應答清除腫瘤細胞，且與細胞遺傳學有關。CD8+T細胞主要包括CD3+CD4-CD8+CD28+細胞和CD3+CD4-CD8+CD28-細胞，CD3+CD4-CD8+CD28+細胞即殺傷性T細胞，是一類細胞毒效應細胞，對病毒感染或帶有致敏抗原的腫瘤細胞具有特異殺滅作用。CD3+CD4-CD8+CD28-細胞即抑制性T細胞，通過抑制抗體產生和T細胞活化，發揮體液和細胞免疫抑制作用。本研究對殺傷性T細胞百分數進行了檢測，發現兩組CD8+CD28+/CD8+百分比與對照組比較均無明顯變化，在FISH高危組和FISH無高危組之間差異也無統計學意義，提示MM患者殺傷性T細胞并未明顯升高，若有CD8+T淋巴細胞增殖推測與抑制性T細胞增多有關。另外，HLADR和CD38是CD8+T細胞活化的標志性分子，本研究發現，相對于健康對照組，兩組CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比均顯著升高，相對于FISH無高危組，FISH高危組CD8+HLADR+/CD8+百分比顯著升高，提示CD8+T細胞功能異常活化導致MM患者免疫功能下降，清除腫瘤細胞能力減弱，且與細胞遺傳學有關。

MM的預后因素包括年齡、血紅蛋白水平、肌酐水平β2-MG等，β2-MG水平能反映骨髓瘤細胞總量，是MM國際分期標準的參考因素之一[15]。本研究發現CD8+細胞、CD8+HLADR+/CD8+、CD4+CD28+/CD4+百分比與細胞遺傳學有關，所以進一步通過Person直線相關性分析對三者與血清β2-MG水平進行分析，結果發現CD8+細胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比與血清β2-MG水平呈正相關，CD4+CD28+/CD4+百分比與β2-MG呈負相關，說明T細胞的異常與MM預后相關。

綜上所述，外周血CD4+T細胞功能缺陷、CD8+T淋巴細胞異常增生以及CD8+T細胞功能異常活化是造成MM患者免疫功能缺失的主要原因，且與患者細胞遺傳學危險度分層之間存在一定的相關性。細胞遺傳學危險度在一定程度上決定了患者預后情況，為進一步確定免疫功能缺陷與MM預后的關系，本研究分析發現CD8+細胞、CD8+HLADR+/CD8+CD4+、CD28+/CD4+百分比均與預后因子血清β2-MG水平相關。所以以上三種細胞可能成為疾病預后的判斷指標，值得臨床深入研究。