亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤不良反應的相關性研究

何 霞，姚平立，吳 宇，侯正堯，李星星，張 遠，串俊蘭，鐘 磊，肖洪濤，，童榮生，

(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院藥學部，四川 成都 610072；2.電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都 611731)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是臨床常見的惡性血液腫瘤疾病，其發(fā)病率高，進展迅速，且在兒童中更為顯著[1]。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是治療ALL的一線藥物，MTX是一種競爭性葉酸還原酶抑制劑，通過與二氫葉酸還原酶的結合阻礙四氫葉酸合成，進而抑制腫瘤細胞的生長繁殖。與常規(guī)劑量MTX相比，大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)可更好地克服耐藥性，故廣泛用于髓外白血病的防治。不同患者對MTX的敏感性及耐受程度不同，可能出現(xiàn)不同的化療副反應，藥物基因多態(tài)性(SNP)被認為是影響HD-MTX不良反應的重要因素之一[2]。本研究擬探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的SNP與ALL患兒使用HD-MTX后不良反應發(fā)生的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2015年10月至2018年9月在四川省人民醫(yī)院兒科血液組確診為ALL的住院漢族患兒70例。具體診斷標準、危險度分型及治療方案均參照兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)[3]。所有納入研究的患兒處于HD-MTX鞏固化療階段，年齡0～16歲；排除早期強化治療后未完全緩解以及HD-MTX 化療前血常規(guī)和肝腎功、電解質(zhì)、心肌酶學指標不正常者。其中男45例，女25例，年齡(8.27±4.65)歲；免疫分型B型患兒44例，T型12例，其他12例；危險度分級[3]：標危患兒3例，中危18例，高危49例。該研究在中國臨床實驗中心注冊，通過我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有對象的診療已征得監(jiān)護人同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1給藥方法 參照兒童ALL 診療建議[3]，MTX 以低危組為2.0 g / m2，中危及高危組均為 5.0 g/m2的劑量給藥，總劑量的 1 /10作為突擊量于前 30 分鐘內(nèi)快速靜脈滴入，余量于后 23.5 h內(nèi)勻速滴入。突擊量MTX 滴入后 0.5～2 h，進行三聯(lián)鞘內(nèi)注射 (MTX12.5 mg、阿糖胞苷35 mg，地塞米松5 mg)。

1.2.2MTX血漿濃度測定 經(jīng)HD-MTX治療患兒于靜脈滴注MTX后24 h、48 h、72 h采對側(cè)上肢靜脈血2 ml于抗凝管中，使用均相酶放大免疫分析技術(EMTI)(西門子Viva-E全自動分析儀)測定MTX血漿濃度。

1.2.3基因分型檢測 采外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，用血液基因組柱式小量提取試劑盒(康為世紀公司，批號：20228)提取基因組DNA，微量核酸蛋白檢測儀(NanoDrop 2000)檢測DNA 濃度和純度，濃度：10～30 ng/μl；A260/A280：1.6～2.0。MTHFR基因分型采用MTHFR基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司，批號：18030502)。實時熒光定量PCR(ABI7500)進行擴增，擴增條件：37 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個循環(huán)。

1.3不良反應評價監(jiān)測根據(jù)美國國立癌癥研究所常見不良反應評價標準(NCI-CTCAE V4.0) 對患兒進行HD-MTX鞏固化療期首次HD-MTX給藥后7天內(nèi)產(chǎn)生的不良反應進行統(tǒng)一評價，若分級≥2則被認為是發(fā)生臨床相關的化療不良反應。評價觀察主要不良反應(ADR)包括：骨髓抑制、肝功能異常、胃腸道反應、黏膜損害、皮疹、繼發(fā)感染、神經(jīng)系統(tǒng)毒性以及腎功能損害。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)表示為“中位數(shù)(Q25，Q75)”。秩和檢驗比較基因多態(tài)性與MTX48 h劑量校正濃度差異，卡方檢驗分析MTHFR各基因型分別與72 h血藥濃度是否>0.1 μmol/L 和不良反應是否發(fā)生的相關性，并根據(jù)野生型及突變型進行分組比較；Logistic回歸分析年齡、性別、BMI、免疫分型、危險度分型、MTX給藥劑量、血藥濃度、基因型等因素與不良反應發(fā)生的相關性。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1基本人口學信息該研究共納入70例患兒，基因分型結果MTHFR C677 T中野生基因型CC型患兒25例，突變基因型CT型37例，純合突變基因型TT型8例；MTHFRA1298C中野生基因型AA型患兒38例，突變基因型AC型28例，純合突變基因型CC型4例。該研究所涉及所有基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。

2.2基因型與HD-MTX化療后MTX濃度的關系

用藥24 h血藥濃度數(shù)據(jù)缺失較多，予以剔除，不做分析。因血藥濃度監(jiān)測方法限制(最低檢測限0.1 μmol/L)，用藥48 h血藥濃度以具體數(shù)值表示，用藥72 h血藥濃度以≤0.1 μmol/L或>0.1 μmol/L具體患兒例數(shù)表示。MTHFR C677 T、A1298C不同基因型的用藥48 h劑量校正濃度之間差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，MTHFR C677 T、A1298C不同基因型與用藥72 h血藥濃度是否>0.1 μmol/L差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表1。

表1 不同基因型血藥濃度的差異

2.3基因型對不良反應發(fā)生的影響統(tǒng)計顯示骨髓抑制發(fā)生率最高，共38例(54.2%)，肝功能異常23例(32.9%)，胃腸道反應15例(21.4%)，黏膜損害27例(38.6%)，皮疹4例(5.7%)，繼發(fā)感染29例(41.4%)，神經(jīng)系統(tǒng)損害4例(5.7%)，腎功能損害發(fā)生最少，僅2例(2.9%)。其中，僅觀察到MTHFR C677 T CC型(11例)組的胃腸道反應發(fā)生高于CT型(3例)、TT型(1例)組差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

2.4多因素對不良反應的發(fā)生的影響Logistic回歸分析提示：72 h血藥濃度>0.1 μmol/L患兒更易發(fā)生胃腸道不良反應；C677 T 基因多態(tài)性也是胃腸道反應的發(fā)生的影響因素之一；BMI值、免疫分型可能是患兒發(fā)生黏膜損害的影響因素，且提示T系患兒更易發(fā)生黏膜損害；體重的數(shù)值可能影響患兒皮疹發(fā)生。見表2。

表2 ADR發(fā)生的影響因素分析

3 討論

MTHFR是葉酸循環(huán)中有重要作用的酶，催化5，10-亞甲基-THF還原為5-甲基-THF。鄢歡等[4]發(fā)現(xiàn)677C/T型基因突變使纈氨酸替代丙氨酸，導致MTHFR酶的活性下降，造成細胞內(nèi)同型半胱氨酸濃度增高，改變了葉酸分布；MTHFR 1298中C堿基替換了A堿基后，谷氨酸被丙氨酸所替代，導致MTHFR活性降低，兩者的突變均會對葉酸體內(nèi)代謝造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)C677 T位點 CC型發(fā)生胃腸道反應的概率顯著高于突變型(CT+TT型)，可推測677CC型患者可能出現(xiàn)更嚴重的藥物毒性反應，其 C>T位點的突變可能對胃腸道有一定的保護作用。Zhu報道[5]C677 T與HD-MTX所致胃腸道反應發(fā)生相關，提示C677 T位點多態(tài)性可能是HD-MTX化療后胃腸道反應發(fā)生與否的重要因素之一。目前關于MTHFR A1298C 基因型與HD-MTX 化療相關不良反應亦有較多報道，但結論不一致[6，7]。本研究未發(fā)現(xiàn)A1298C基因型與血藥濃度和不良反應的相關性，可能需要進行多中心、大樣本的研究來驗證。

FDA建議臨床可通過監(jiān)測MTX血藥濃度來指導個體化用藥，達到提高療效并減少不良反應發(fā)生的目的，MTX 24 h血藥濃度可用于預測療效，而48、72 h血藥濃度則用于反映MTX在體內(nèi)的消除情況、特別是72 h是否≤0.1 μmol/L用于指導CF解救療程以及預防不良反應的發(fā)生[8]。本研究結果顯示72 h血藥濃度可能影響患兒胃腸道反應的發(fā)生，魏盈盈等[9]的研究也有相同結論，提示血藥濃度監(jiān)測對于HD-MTX的安全用藥具有積極的指導作用。該研究分析得到患兒在給藥前的BMI值、免疫分型類型及體重數(shù)值可能分別為HD-MTX所致黏膜損害、皮疹的發(fā)生的危險因素。提示在ALL患兒的臨床治療中，密切監(jiān)控患兒的體重、BMI數(shù)值等指數(shù)，明確做好患兒免疫分型，對臨床治療ALL患兒，減少HD-MTX化療不良反應有積極作用。

近年來，許多學者認為MTHFR基因多態(tài)性可以作為ALL預后及化療相關不良反應的預測指標，部分醫(yī)院已經(jīng)將藥物基因檢測項目納入醫(yī)院常規(guī)檢測項目，用于指導疾病的治療與預后[10]。本研究病例數(shù)量有限，但其結果可為兒童安全應用HD-MTX提供參考建議，為后續(xù)相關研究提供信息。