Dppz配體10,13-位由芳香基取代的新型單核釕配合物的合成

李敏娜*

(首都醫科大學藥學院化學生物學系，北京 100069)

過渡金屬配合物具有與DNA鍵合的特性，在DNA構象探針、化學藥物治療藥物先導和細胞顯像劑等方面具有潛在應用價值[1-6]。因此，具有高選擇性的DNA結合特性的過渡金屬配合物的設計和合成近年來一直是人們研究的熱點。多吡啶合釕(Ⅱ) 配合物，尤其是二-(1,10-鄰菲羅啉)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine,[Ru(phen)2(dppz)]2+}，詳見圖1，及其衍生物由于其優良的DNA“光開關”能力(在純水溶液中不發光，但在水中加入DNA后，配合物的主配體dppz插入DNA堿基對中，吩嗪上的N原子脫離溶劑H2O的氫鍵作用，發出強光[7])而備受關注。研究[8]表明，與DNA作用的藥物分子具有抗腫瘤活性，有兩點至關重要：一是與DNA較強的鍵合力，二是從DNA解離出來具有較慢的解離速率。據報道[9-10]通過單鍵連接兩個[Ru(phen)2(dppz)]2+的半剛性雙核配合物四-(1,10-鄰菲羅啉)-二聯吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪基合二釕(Ⅱ){diruthenium tetra(phenanthroline)-dipyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine，[bidppz(phen)4Ru2]4+}解離DNA的速率非常慢，類似于具有抗癌活性的天然產物諾加霉素。雙核配合物具有慢的解離速率是由于單核Ru部分較大空間構型，通過或解離DNA時需要至少一個堿基對瞬間打開或堿基對堆疊一起，空間位阻較大，同時也導致了配合物對DNA序列的選擇性[10]。隨后科學家們設計并合成了一系列雙核類似物，并發現輔助配體的親疏水性、橋聯配體靈活性的大小也會影響DNA解離速率[11-14]。雙核配合物雖然部分可獲得較慢解離DNA速率，但由于相對分子質量過大，反應中易形成沉淀，影響其與核酸作用。假設對于單核配合物來講，如果在主配體dppz長軸上引入大的取代基，當其插入DNA堿基對時，較大的空間位阻勢必也能降低配合物解離DNA的速率，避免相對分子質量過大導致的后果?；谝陨峡紤]，早期本課題組就合成了一系列單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物[15-16]，尤其是芳基取代吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪配體的10和13位[16]。令人驚喜的是dppz配體含有噻吩取代的配合物與DNA結合與解離的速度都很慢，屬于嵌插入結合方式，這是繼雙核配合物[11]后第二個能夠以嵌插入模式結合DNA的釕配合物。而二苯基取代的類似物似乎只是取代基中的一個苯基部分插入DNA，從而更快的解離。在這些成果的鼓舞下，本課題組繼而設計并合成了3種以2,2′-聯吡啶(2,2′-bipyridine,bpy)為輔助配體，主配體dppz的10, 13位分別為噻吩、苯及呋喃的單核二-(2,2′-聯吡啶)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(2,2′-bipyridyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine,[Ru(bpy)2(dppz)]2+}衍生物。結果表明3種配合物均以部分插入或溝槽結合與DNA作用，說明輔助配體的性質在DNA結合模式也起著重要的作用[17]。

圖1 配合物二-(1,10-鄰菲羅啉)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)的結構Fig.1 Structure of complex ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine

由于嵌插入方式是一個不尋常的DNA結合模式，顯示出極其緩慢的動力學，它是細胞毒性的一個重要特征，該方式作用的化合物應是新的基于與DNA結合藥物的模型化合物。正如上面提到的，這種結合方式的單核釕配合物目前報道的僅僅是10和13位含有二噻吩基取代dppz配體、鄰菲羅啉為輔助配體的配合物。為此，進一步設計以鄰菲羅啉輔助配體，dppz配體10, 13位取代的新的釕配合物并探索分子結構與DNA結合特性之間的關系具有十分重要的意義。因此，筆者設計并合成了新的單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物方案，為二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(2-噻吩基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)[ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine， Ru-T];二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(2-呋喃基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)[ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine， Ru-F];二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(4,7-苯并噻吩基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine， Ru-BT};二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(4,7-苯并呋喃基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c，phenazine， Ru-BF}。為了研究芳香基上雜原子范德華半徑及電子分布對釕配合物與DNA作用的影響，與前期報道的10,13-二(2-噻吩) 取代dppz配體的 [Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T)進行對比，設計出由呋喃取代dppz配體的目標分子Ru-F。為了探討取代基的大小對釕配合物與DNA作用的影響，分別對比Ru-T和Ru-F，設計出dppz配體分別由2-苯并噻吩和2-苯并呋喃取代的目標分子Ru-BT和Ru-BF。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

本論文所用的溶劑均為分析純，購于北京化工試劑公司。除無水乙醇外均直接用于實驗中。氘代DMSO，氘代氯仿、2-呋喃硼酸、四-(三苯基磷)合鈀(0)催化劑均從百靈威科技有限公司購置。

旋轉蒸發儀(Laborota 4000)購自德國Heidolph Instruments公司；磁共振光譜儀上(500 MHz)、高分辨質譜儀 (Micro-TOF-Q)購自美國Bruker公司；紫外-可見分光光度計 (UV-2550)購自日本島津公司。

中間體二氯-二-(1.10-鄰菲羅林)合釕(Ⅱ){ruthenium di-(1,10-phenanthroline)dichloride，cis-[Ru(phen)2Cl2]}[18]，二氯-二-(1.10-鄰菲羅林)-1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮合釕(Ⅱ){ruthenium di(1,10-phenanthroline)-1,10-phenanthroline-5,6-dione-dichloride),[Ru(phen)2(pq)]Cl2}[19]和4,7-二(2-噻吩基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole，T], 4,7-二(2-苯并(b)噻吩基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-benzo(b)thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole，BT]和4,7-二(2-苯并(b)呋喃基-苯并噻二唑[4,7-bis(2-benzo(b)furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole，BF] 根據文獻[16-17]的制備程序得到。

1.2 實驗方法

1.2.1 無水乙醇的干燥

將200 mL 99%(體積分數)的無水乙醇置于500 mL 圓底燒瓶中，加入5 g 鎂條，回流4 h后，蒸餾，收集78～80 ℃餾分，待用。

1.2.2 4,7-二(2-呋喃基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole， F]的合成

F的制備方法和筆者前期報道[16]的4,7-二(2-噻吩基)-苯并噻二唑的合成相同，即是通過Suzuki 偶聯反應。4,7-二溴苯并(1,2,5)噻二唑的混合物(88 mg，0.3 mmol)，2-呋喃硼酸(111 mg，1 mmol)、碳酸鉀(414 mg，3 mmol)和Pd(PPh3)4(47 mg，0.04 mmol)在二氧六環和水的混合溶劑 (體積比為4∶1, 8 mL)中，N2保護下回流。薄層色譜法監測反應過程(硅膠板，石油醚作展開劑，Rf= 0.3)。溶液的顏色由紅色變為棕色，最后變成橙色。待原料消失，停止反應。將反應液冷卻至室溫，加入40 mL 水，然后采用二氯甲烷(3×10 mL)萃取。得到的萃取液經無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，得到的溶液在減壓下旋干。然后以石油醚為洗脫劑，在硅膠柱上進行分離，得到橙黃色固體32 mg，產率40%。1H NMR δH(500 MHz, CDCl3) 6.66 (2H, J=2.0 Hz, d), 7.62 (s, 2H), 7.72 (2H, J=3.0 Hz, d), 8.08 (s, 2H);13C NMR (500 MHz, CDCl3) 112.16, 112.48, 121.80, 123.52, (142.80), 150.017, 151.33; TOF-MS 269.043 5 ([M+H+]), 相對分子質量269.037 9。

1.2.3 3,6-二(2-呋喃基)-1,2-二胺基苯的合成

3,6-二(2-呋喃基)-1,2-二胺基苯的制備方法參考Dasilveria等[20]報道的3,6-二芳香基鄰苯二胺的合成。4,7-二呋喃苯并(1,2,5)噻二唑(0.2 mmol)，硼氫化鈉 (11 mg，0.3 mmol)和CoCl2·6H2O (10 mg，0.04 mmol)溶解在5 mL干燥的乙醇中。在氬氣保護下將得到的懸浮液回流10 min。溶液變成無色并且有黑色固體Co2B析出，同時有H2S氣體放出。反應混合物冷卻至室溫，過濾。得到的濾液加入15 mL水，接著用乙醚萃取(3×10 mL)。萃取液組合在一起，加入無水Na2SO4干燥，減壓下蒸干溶劑即得到無色固體即為目標產物。由于鄰苯二胺類似物在空氣中不穩定，為避免其快速分解，通常立即將其應用于下步的反應中，無表征數據。幸運的是，本課題組對得到的固體快速置于經K2CO3過濾的氘代氯仿中，經磁共振儀得到了3,6-二呋喃基鄰苯二胺的磁共振圖譜。1H NMR δH(500 MHz, CDCl3) 6.55 (s, 2H), 6.63 (2H, J=3.0 Hz, d), 7.08 (s, 2H), 7.55 (s, 2H);13C NMR (500 MHz, CDCl3) 106.92, 111.43, 116.74, 118.28, 132.63, 141.47, 153.65; TOF-MS 241.1019 ([M+H+]),相對分子質量 241.0972.

1.2.4 dppz配體的10,13-位由芳香基取代的幾種單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T，Ru-F，Ru-BT和Ru-BF)的合成

幾種目標配合物的合成方法相同。制備過程如下： 3,6-二芳香基鄰苯二胺類中間體(0.05 mmol)，[Ru(phen)2(pq)]Cl2(0.025 mmol，19 mg)溶解在1 mL乙腈中，加入一滴乙酸。反應液在暗處、氬氣保護下回流10 min，冷卻至室溫。溶液顏色由深棕色變為深紅色。向反應液中加入飽和NH4PF6水溶液1 mL，發現橙紅色沉淀，過濾，先后用水(3 × 5 mL)和乙醚(3 × 5 mL)洗滌，真空干燥。得到的固體經氧化鋁柱層析純化，乙腈為洗脫劑，得到橙紅色固體為目標產物的六氟磷酸鹽形式。將六氟磷酸鹽的產物溶于2 mL丙酮中，得到紅色溶液，加入少量氯化銨，得到橙紅色沉淀，過濾，先后用丙酮(3 × 3 mL)和乙醚(3 × 3 mL)洗滌，真空干燥。得到了目標產物的氯鹽形式。每個單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物的表征數據如下。

1.2.5 芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)及對應的單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF) 紫外-可見吸收光譜的測定

分別稱量4種中間體5 × 10-3mmol，溶解于10 mL CH2Cl2中，配成500 μmol/L溶液。然后取100 μL該溶液用CH2Cl2稀釋成1 mL即得到待測樣品溶液。配合物樣品溶液的配制方法同上。

2 結果

2.1 單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的合成過程

中間體配合物[(phen)2Ru(pq)] Cl2與相應的3,6位含有芳香基取代的鄰苯二胺在含有乙酸的乙腈溶液中回流發生縮合反應得到4種對應的目標配合物。而鄰苯二胺衍生物是首先通過典型的Suzuki 偶聯反應，即4,7-二溴苯并噻二唑與硼酸類似物在(PPh3)4做催化劑，堿性條件下回流得到4,7-呋喃苯并(1,2,5)噻二唑。該物質再經CoCl2催化，NaBH4還原得到對應的3，6-二(2-呋喃基)鄰苯二胺。最后，本研究對中間體和配合物進行了1H NMR、13C NMR和TOF-Mass的表征，詳見圖2。

2.2 芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)的紫外-可見吸收光譜

4種苯并噻二唑衍生物的紫外-可見光吸收光譜如圖3。盡管4種中間體在結構上不同，它們在二氯甲烷溶液中的吸收光譜形狀相似。在280～300 nm處出現一個狹窄的吸收，歸屬于芳香環部分的π-π*躍遷，440～460 nm 處寬的吸收帶來源于分子內電荷轉移(intramolecular charge transfer,ICT)，即電荷從芳香基取代基轉移到苯并噻唑部分。另外，隨著共軛體系的增長，這兩個吸收帶均發生了紅移。比較中間體F和T，低能級吸收帶的最大吸收波長略有紅移，這可能是雜原子不同的供電性造成的。相似的現象可以在比較BF和BT中觀察得到。在高能級吸收帶沒有看到明顯的該特點。

圖2四種中間體(T、F、BT和BF)及對應的[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的合成路線

Fig.2Thesyntheticroutesoffourintermediates(T、F、BTandBF)andtheircorresponding[(phen)2Ru(dppz)]2+derivatives(Ru-T、Ru-F、Ru-BTandRu-BF)

Reaction conditions: 1) boric acid analogues, Pd(PPh3)4, K2CO3, dioxane/H2O (4/1), reflux; 2) NaBH4, CoCl2, EtOH, reflux; 3) [(phen)2Ru(pq)]Cl2, CH3CN, HOAc, reflux；Ru-T：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-F：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-BT：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine；Ru-BF：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-[3,2-a:2′,3′-c]phenazine).

圖3芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)在CH2Cl2中的紫外-可見吸收光譜(50μmol/L)

Fig.3UV-visabsorptionspectraof4,7-diaryl-2,1,3-benzothiadiazoles(T、F、BTandBF)inCH2Cl2(50μmol/L)

T：4,7-bis(2-thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole；F：4,7-bis(2-furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole；BT：4,7-bis[2-benzo(b)thienyl]-2,1,3-benzothiadiazole；BF：4,7-bis[2-benzo(b)furanyl]-2,1,3-benzothiadiazole.

2.3 單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的紫外-可見吸收光譜

4種[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物在水中的UV-Vis吸收光譜詳見圖4。由圖可以看出，4種配合物具有相似的吸收光譜，主要包括4個特征吸收譜帶。在最大吸收波長265 nm處有個強而窄的吸收，歸屬于兩個輔助配體鄰菲羅啉的π-π*躍遷；最大吸收波長450 nm處寬峰是典型的金屬到配體的電荷轉移(metal to ligand charge transfer,MLCT)產生的吸收；375 nm強度適中的譜帶來源于dppz配體長軸 π-π*躍遷。與母體配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+相比，dppz配體的10,13-位被兩個芳香基團取代，375 nm 處dppz配體 π-π*躍遷導致的最大吸收波長略有紅移，與MLCT吸收帶發生部分重疊。來源于芳香基取代dppz配體的縱軸方向上的315 nm處π-π*躍遷在Ru-T，Ru-F和Ru-BF中相似，和Ru-BT相比略有藍移，這可能是由整個分子的極性及共軛效應決定的。 Ru-F的315 nm處吸收強度比Ru-T、Ru-BT和Ru-BF低，可能歸因于配合物在水中的π堆積效應。

圖44種[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF在水中的紫外-可見吸收光譜(150μmol/L)

Fig.4UV-visabsorptionspectraoffour[(phen)2Ru(dppz)]2+derivatives(Ru-T,Ru-F,Ru-BTandRu-BF)inwater(150μmol/L)

Ru-T：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-F：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-BT：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine；Ru-BF：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-[3,2-a:2′,3′-c]phenazine)；[(phen)2Ru(dppz)]2+：ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine.

3 討論

自從明星配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+作為優良的DNA光開關被發現，化學家們開始對該配合物進行結構修飾，努力探索出分子結構與DNA作用動力學的關系，為開發出新型DNA探針及抗腫瘤藥物奠定重要的基礎。本論文通過化學合成方法制備出了dppz配體10,13-位由兩個芳香基取代的4種[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物，并對苯并噻唑類中間體、目標配合物進行了核磁共振和質譜的表征。文獻[20]報道的鄰苯二胺類物質在空氣中極其不穩定，通常是除去溶劑后直接用于下步反應。本研究對于不穩定的鄰苯二胺衍生物通過快速溶解樣品于經K2CO3過濾的氘代氯仿中，得到了該化合物的核磁共振圖譜及質譜。同時，4種配合物具有與母體配合物相似的紫外-可見吸收光譜，進一步驗證目標配合物結構。目標配合物與DNA的相互作用目前在研究中，有望為開發出新型DNA探針及基于DNA鍵合的藥物奠定一定的理論基礎。