比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)體外受精胚胎培養(yǎng)對臨床結(jié)局的影響

陳博 孫曉巖 韓臨曉 李青洋 趙麗 蔡昭煒 陳雪梅

【摘要】 目的：比較延時攝像胚胎觀測技術(shù)（time-lapse）培養(yǎng)和常規(guī)體外受精（IVF-ET）胚胎培養(yǎng)對臨床結(jié)局的影響。方法：回顧性分析2016年8月-2017年5月58例time-lapse培養(yǎng)周期和125例常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期的臨床結(jié)果。比較time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期的卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D3可用胚胎數(shù)、種植率、臨床妊娠率。結(jié)果：time-lapse培養(yǎng)周期組和常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期組的卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D3可用胚胎數(shù)、多胎率、種植率、累計移植次數(shù)和累計妊娠率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組臨床妊娠率（62.5% vs 41.0%）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：延時攝像胚胎觀測技術(shù)（time-lapse）有助于預(yù)測胚胎發(fā)育潛能，可以改善胚胎選擇方法，對傳統(tǒng)的胚胎挑選給予新的思路。

【關(guān)鍵詞】 時差成像技術(shù) 胚胎培養(yǎng) 胚胎評估

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.30.080 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）30-0-03

[Abstract] Objective： To compare the clinical outcomes of time-lapse embryo observation （time-lapse） and conventional in vitro fertilization （IVF-ET） embryo cultures. Method： The clinical results of 58 time-lapse cycles and 125 conventional IVF embryo culture cycles from August 2016 to May 2017 were analyzed retrospectively. The number of cleavage， number of high-quality embryos （D3）， number of available embryos （D3）， implantation rate and clinical pregnancy rate were compared between time-lapse lapse culture cycle and conventional IVF embryo culture cycle. Result： There was no significant difference in the number of cleavage， number of high-quality D3 embryos， number of available D3 embryos， multiple embryo rate， implantation rate， cumulative transfer times and cumulative pregnancy rate between the time-lapse cycle group and the conventional IVF cycle group （P>0.05）， The clinical pregnancy rate （62.5% vs 41.0%） was statistically different between the two groups （P<0.05）. Conclusion： Time-lapse imaging （time-lapse） can be used to predict the development potential of embryos， improve the method of embryo selection， and give new ideas on the selection of conventional embryos.

[Key words] Time-lapse imaging technique Embryo culture Embryo assessment

First-authors address： The Third Peoples Hospital of Dongguan City， Dongguan 523326， China

在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過程中，胚胎的發(fā)育潛能是影響臨床結(jié)果的重要因素[1]。因此，如何正確判斷和選擇具有良好發(fā)育潛能的胚胎，保證較好的臨床妊娠結(jié)局已成為胚胎學(xué)研究的焦點[2-3]。延時攝像技術(shù)（time-lapse，TLI）是一種瞬時曝光連續(xù)拍攝的成像技術(shù)[4-6]，通過對胚胎整個體外培養(yǎng)階段進行監(jiān)測，保證觀察過程中胚胎發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定，還能獲取胚胎發(fā)育各個階段的形態(tài)以及各事件發(fā)生的特定時間，為胚胎形態(tài)評估提供更為客觀、精準的方式，進而根據(jù)胚胎動力學(xué)參數(shù)有效地評估胚胎的發(fā)育潛力，為篩選出最優(yōu)發(fā)育條件的胚胎進行移植。本研究旨在分析比較TLI培養(yǎng)和常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)對臨床結(jié)果的影響，探討TLI培養(yǎng)是否更有利于選擇高潛能胚胎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年8月-2017年5月在筆者所在醫(yī)院生殖中心行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）治療的不孕癥患者。納入標準：（1）臨床方案均采用標準長方案，年齡23～39歲;（2）不孕因素：女方輸卵管因素、男方少弱畸精子癥患者。排除標準：女性子宮因素（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等）及其他疾病因素（卵巢儲備功能下降、染色體異常、多囊卵巢綜合征等）。由于Primo Vision胚胎培養(yǎng)皿（Vitrolife，瑞典）最多只能放置16個胚胎，所以所有入選周期2PN受精數(shù)≤16個。試驗中所有患者被隨機分成TLI組和常規(guī)IVF組。其中58例周期采用TLI培養(yǎng)和125例采用常規(guī)培養(yǎng)方法。兩組患者年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)E2、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、Gn天數(shù)和Gn劑量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

1.2 方法

1.2.1 取卵受精 取卵后根據(jù)臨床指征行IVF或ICSI。IVF授精：受精濃度為5×106/ml，過夜受精;ICSI授精：撿卵4 h剝除顆粒細胞后行ICSI。

1.2.2 胚胎培養(yǎng) 常規(guī)組將脫顆粒胚胎轉(zhuǎn)移至卵裂皿（G-1 Plus，Vitrolife，瑞典）觀察胚胎發(fā)育情況;TLI組將正常受精胚胎轉(zhuǎn)移至Primo Vision專用培養(yǎng)皿（well of the well）[7]，置于時差監(jiān)測系統(tǒng)。設(shè)置拍攝間隔頻率為10 min，7個等距的焦平掃描間隔頻率1 h，連續(xù)拍攝3 d。

1.2.3 胚胎質(zhì)量評估 常規(guī)組培養(yǎng)至第3天，根據(jù)卵裂球數(shù)目、均一度及碎片進行評分并挑選胚胎移植[8];TLI組在常規(guī)組的基礎(chǔ)之上參考原核消失時間（20 h 45 min～25 h）、3～4細胞的時間（<75 min）指標[9-12]。優(yōu)質(zhì)胚胎和可用胚胎評價指標參照胚胎試驗室關(guān)鍵指標質(zhì)控專家共識[13]。

1.3 觀察指標及評價標準

觀察兩組培養(yǎng)胚胎發(fā)育情況及培養(yǎng)臨床結(jié)局情況。移植后4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠。移植后4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊數(shù)量與移植胚胎數(shù)目之比為種植率;一次妊娠同時懷有2個及以上的胎兒時稱為多胎率;累計移植次數(shù)指在一個藥物刺激周期獲得全部胚胎經(jīng)過鮮胚或凍胚移植的總次數(shù);累計妊娠指在一個藥物刺激周期獲得全部胚胎經(jīng)過鮮胚或凍胚移植后獲得臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胚胎發(fā)育結(jié)果比較

TLI培養(yǎng)周期和常規(guī)IVF培養(yǎng)周期的患者的獲卵數(shù)、卵子成熟數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D2優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和D3可用胚胎數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.2 TLI和常規(guī)培養(yǎng)臨床結(jié)局

TLI培養(yǎng)周期和常規(guī)IVF培養(yǎng)周期患者的移植數(shù)量、子宮內(nèi)膜厚度、多胎率、流產(chǎn)率、累計移植次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但是兩組新鮮臨床妊娠率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

Azzarello等[9]通過time-lapse對159個移植正常受精胚胎活產(chǎn)嬰兒結(jié)局發(fā)現(xiàn)其原核消失時間早于20 h 45 min的胚胎沒有活產(chǎn)現(xiàn)象，結(jié)合Lemmen[8]的研究可以推測活產(chǎn)的胚胎原核消失應(yīng)該在20 h 45 min～25 h，同時Meseguer等[11]將胚胎卵裂參數(shù)與臨床結(jié)果結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)3個胚胎著床能力相關(guān)的參數(shù)分別是：（1）分裂到5細胞的時間t5在48.8～56.6 h;（2）第二次卵裂的同步性s2在0.76 h以內(nèi);（3）第二個細胞周期的持續(xù)時間，即分裂2細胞和3細胞的時間間隔cc2在11.9 h。因此本研究在TLI培養(yǎng)周期選取的移植胚胎均參考原核消失時間和第二次卵裂同步性作為標準與常規(guī)IVF培養(yǎng)周期的患者進行對照研究，發(fā)現(xiàn)在移植相同數(shù)目的胚胎情況下，TLI培養(yǎng)周期的新鮮妊娠率顯著高于常規(guī)IVF培養(yǎng)周期（P<0.05），多胎率（35% vs 20.6%）和種植率（40.6% vs 29.5%）雖然TLI培養(yǎng)周期高于常規(guī)培養(yǎng)周期，但是差異不顯著（P>0.05），可能與例數(shù)較少有關(guān)，當有較多優(yōu)質(zhì)胚胎可選擇時運用TLI技術(shù)結(jié)合胚胎分裂模式挑選胚胎可以提高臨床妊娠率。這與唐永梅等[14]和梁泳娜等[15]研究相反，據(jù)分析可能與入組患者年齡偏大及觀察受精卵數(shù)少，平均移植胚胎數(shù)少（平均移植1.3 個胚胎或囊胚）有關(guān)。

另外本研究還發(fā)現(xiàn)TLI培養(yǎng)周期和常規(guī)IVF培養(yǎng)周期的在累計臨床妊娠的情況下，雖然TLI培養(yǎng)周期的累計妊娠率高于常規(guī)IVF培養(yǎng)周期，但無顯著性差異（P>0.05），另外累計移植妊娠的次數(shù)無顯著差異（P>0.05），這也間接說明除了挑選胚胎的重要性以外，還有方案、子宮內(nèi)環(huán)境、人員操作、培養(yǎng)基、患者自身情況等其他因素也會導(dǎo)致臨床妊娠率的變化。不過針對預(yù)后性較好的年輕患者，可以通過TLI技術(shù)篩選單個發(fā)育潛能最佳的胚胎進行移植，可以降低單胎率。

綜上所述，通過時差成像系統(tǒng)觀察胚胎動力學(xué)參數(shù)及卵裂模式等事件判斷胚胎的發(fā)育潛能，為臨床提供最佳優(yōu)質(zhì)胚胎進而改善臨床結(jié)局;同時時差成像系統(tǒng)從另一個角度給胚胎學(xué)家提供一個新的視野，對未使用時差成像系統(tǒng)進行挑選胚胎時提供新的思路。

參考文獻

[1] Pereira N，Brauer A A，Melnick A P，et al.Prognostic value of growth of 4-cell embryos on the day of transfer in fresh IVF-ET cycles[J].J Assist Reprod Genet，2015，32（6）：939-943.

[2] Drábková P，Andrlová L，Hampl R，et al.Changes in the levels of selected metabolites in the culture medium as a possible tool for the embryo selection in assisted reproduction[J].Ceska Gynekol，2015，80（2）：135-139.

[3] Kort D H，Chia G，Treff N R，et al.Human embryos commonly form abnormal nuclei during development：a mechanism of DNA damage，embryonic aneuploidy，and developmental arrest[J].Hum Reprod，2016，31（2）：312-323.

[4] Ajduk A，Ilozue T，Windsor S，et al.Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability[J].Nat Commun，2011（2）：417.

[5] Pribenszky C，Mátyás S，Kovács P，et al.Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time-lapse monitoring[J].Reprod Biomed Online，2010，21（4）：533-536.

[6] Chavez S L，Loewke K E，Han J，et al.Dynamic blastomere behavior reflects human embryo ploidy by the four-cell stage[J].Nat Commun，2012（3）：1251.

[7] Peter R B.Textbook of in vitro fertilization and assistedreproduction[M].Third edition.New York：TheParthenon Publishing Group Inc， 1999： 196-197.

[8] Lemmen J G，Agerholm I，Ziebe S.Kinetic markers of humanembryo quality using time-lapse recordings of IVF/ICSI-fertilizedoocytes[J].Reprod Biomed Online，2008，17（3）：385-391.

[9] Azzarello A，Hoest T，Mikkelsen A L.The impact of pronucleimorphology and dynamicity on live birth outcome after time-lapseculture[J].Hum Reprod，2012，27（9）：2649-2657.

[10] Wong C C，Loewke K E，Bossert N L，et al.Non-invasive imaging ofhuman embryos before embryonic genome activation predictsdevelopment to the blastocyst stage[J].Nat Biotechnol，2010，28（10）：1115-1121.

[11] Meseguer M，Herrero J，Tejera A，et al.The use of morphokineticsas a predictor of embryo implantation[J].Hum Reprod，2011，26（10）：2658-2671.

[12]孫青，黃國寧，孫海翔，等.胚胎試驗室關(guān)鍵指標質(zhì)控專家共識[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2018，29（9）：836-852.

[13]石江霞，張碩屏，龔斐，等.延時攝像在人類輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2013，40（4）：358-365.

[14]唐永梅，秦祖興，李忻琳.胚胎培養(yǎng)密度對胚胎發(fā)育潛能的影響[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2018，26（1）：118-120.

[15]梁泳娜，梁見弟，陳燕鋒，等.時差成像系統(tǒng)挑選優(yōu)質(zhì)胚胎對IVF-ET妊娠結(jié)局的改善作用[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2018，8（17）：13-17.

（收稿日期：2019-05-30） （本文編輯：張亮亮）