暴露高活性晶面的TiO2納米管的制備及生物活性

權 月，尹 杰，王園園，包斯元，魯 雄,2，馮 波,2，周 杰,2

(1 西南交通大學 材料科學與工程學院，成都 610031； 2 西南交通大學 材料先進技術教育部重點實驗室，成都 610031)

鈦及鈦合金因具有良好的生物相容性，被廣泛應用在人工骨關節、形狀記憶合金等醫用領域[1-2]。鈦本身為生物惰性，且大部分反應都發生在鈦表面的TiO2層，其生物學性能主要由其表面結構所決定，為增強其生物活性，常對其進行表面改性以適應不同的生物應用環境。

銳鈦礦型TiO2相較于金紅石型有較高的生物活性和穩定性，因此受到較多關注[3-5]。而銳鈦礦型TiO2不同晶面具有不同的原子密度，從而使得具有不同優勢晶面族的TiO2具有不同的表面能和化學活性。其中，銳鈦礦TiO2晶面中表面能依次為(101)(0.44J/m2)<(100)(0.53J/m2)<(001)(0.90J/m2)[6-8]，表面能越大的晶面具有相對更好的潛在化學活性。一般來說，TiO2中晶面的分布遵從Wulff規則[9-11]，銳鈦礦中主要以表面能較小熱力學穩定的(101)面為主，而較高能量的活性表面(001)晶面較少。由于(001)晶面具有更高的潛在化學活性，近年來，制備具有更高比例(001)晶面的銳鈦礦TiO2引起了廣大研究者濃厚的興趣，并取得了一定的進展[12-14]。Yang等[15]以四氟化鈦為前驅體，氫氟酸為生長控制劑，180℃水熱反應不同時間后，得到規整的四方錐截面狀TiO2，其(001)晶面比例達47%。隨后，此課題組[6]研究了合成暴露(001)晶面的TiO2，然而制備方法都是采用HF作為生長控制劑以穩固(001)晶面族。探索低氟或無氟的合成方法成了目前TiO2晶面定向合成的一個研究熱點。同時，對于TiO2晶面的性能研究目前還主要集中在其光電應用方面[16-17]，而關于TiO2中晶面比例對生物學性能的研究較少。

本工作在前期陽極氧化制備TiO2納米管工作的基礎上[18-19]，采用多次陽極氧化技術，通過調節電解液中H2O含量制備具有不同晶面族比例的高度有序的TiO2納米管陣列。通過掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)對試樣進行表面形貌表征，采用生物礦化和蛋白吸附來考察不同晶面對TiO2納米管生物活性的影響。

1 實驗

1.1 試樣制備

純鈦片(TA2，φ10mm×1.5mm)打磨和預處理后，在HF∶HNO3∶H2O=1∶4∶5(體積比)的混酸中進行化學拋光，清洗、干燥備用。40V恒壓下反應120min，然后在去離子水中超聲震蕩，將TiO2納米管層剝離。樣品清洗烘干后進行第二次陽極氧化，恒定電壓40V。電解液配比及陽極氧化時間如表1所示。陽極氧化結束后進行熱處理，450℃保溫120min。

表1 陽極氧化工藝參數Table 1 Technological parameters of anodic oxidation

1.2 生物礦化

每種樣品設置3個平行樣，浸入2倍濃度模擬體液(2×SBF)，放置于37℃恒溫水浴震蕩箱中(60r/h)恒溫震蕩，每24h換一次液，分別在3天和7天取出試樣，室溫干燥。利用SEM和XRD對試樣進行檢測，并用稱重法計算各個試樣礦化前后平均增重。

1.3 蛋白吸附

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為溶劑，配制牛血清白蛋白(BSA,1mg/mL)溶液。各試樣分別浸入45mL BSA溶液中，37℃水浴恒溫震蕩，分別吸附0.5，1，2，4，6，12，24h后取出2mL BSA溶液。通過紫外分光光度計(UV，UV-2550)在280nm波長處測量試樣BSA溶液的吸光度，計算試樣表面蛋白質的吸附量；采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測量試樣表面吸附的BSA結構中的酰胺特征鍵。

1.4 樣品表征

采用掃描電鏡(FEI，Quanta200)觀察試樣陽極氧化后的表面形貌；利用(PANalytical X Pert Pro)X射線衍射儀檢測晶體學特征，加速電壓40kV，電流40mA，Cu靶，掃描范圍20°～80°，掃描模式為連續掃描；用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀(ATR-FTIR，Nicolet SXFYIRI 70/Magna 550)研究蛋白吸附后樣品表面的成分；利用能量色散光譜(EDS，FEI，Quanta200)分析試樣生物礦化后表面元素情況。

2 結果與討論

圖1是電解液中含H2O為1%，2%，3%和4%的一次陽極氧化后各試樣表面的SEM圖。可以看出，經過一次陽極氧化后TiO2納米管呈簇狀分布，簇與簇之間存在較大縫隙，且有相互傾軋的趨向，管口有大量的破損。這可能是由于在有機電解液體系中納米管表面的不均勻腐蝕形成的。電解液中H2O含量的不同會造成納米管生長速率的不一致，為了得到形貌高度有序且管長近似一致的納米管陣列，將各試樣進行不同時間的二次陽極氧化，表面形貌及斷面如圖2所示。各樣品表面納米管陣列呈網狀分布，且管狀趨近堅固的蜂窩結構，管徑大小均勻，約90～110nm，表面光滑，管口無破損及長短不一的情況。由圖2右上的斷圖面可以看出，經過不同時間的二次陽極氧化后，樣品的管長都在4μm左右。說明經過兩次陽極氧化后，各樣品表面TiO2納米管陣列形貌規整，管徑及管長基本保持一致。

圖1 一次陽極氧化后試樣的SEM圖 (a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.1 SEM images of the samples after the first anodic oxidation (a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

圖2 不同時間二次陽極氧化后試樣的SEM圖(a)45min；(b)60min；(c)75min；(d)90minFig.2 SEM images of the samples after the second anodic oxidation with different time(a)45min；(b)60min；(c)75min；(d)90min

圖3為經過二次陽極氧化和熱處理后各樣品的XRD譜圖。熱處理后納米管轉換成銳鈦礦型，但是由于所形成的納米管層比較薄，有部分X射線穿透照射到鈦基底，所以XRD譜圖上出現了鈦峰。一般而言，銳鈦礦TiO2最強衍射峰為(101)晶面，位于2θ=25.28°。然而在2%H2O條件下制備的TiO2納米管樣品，其位于37.8°的(004)晶面的衍射峰強度卻明顯強于(101)晶面峰強，(004)晶面為優勢晶面。說明通過改變電解液中H2O含量，可以讓TiO2沿著[001]晶向擇優生長，即表現出一定的紋理。雖然這種納米管的生長行為在以往的文獻中也有報道[16,20-21]，但很少有深入研究其結構和性能的。

圖3 二次陽極氧化和熱處理后試樣的XRD譜圖(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2OFig.3 XRD patterns of the samples after the secondary anodic oxidation and heat treatment(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

當一種材料晶體學取向發生變化時，可以用織構系數Tc(hkl)半定量地衡量指定晶面取向變化的程度，其范圍為1(無紋理)到N(單取向晶體)。銳鈦礦TiO2(004)晶面的織構系數Tc(004)可以根據Ariosa等報道的方法[22]，用式(1)進行計算。

(1)

表2 (004)晶面的織構系數和強度比值Table 2 Texture coefficient and intensity ratio of (004) facet

圖4為生物礦化3天和7天后試樣表面的SEM圖。可以觀測到所有樣品表面都被一層沉積物所覆蓋，說明試樣表面的納米管結構能夠使鈣磷鹽沉積。

圖4 礦化3天(1)和7天(2)后試樣表面SEM圖(a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.4 SEM images of the samples surface mineralized 3 days(1) and 7 days(2)(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

電解液中H2O含量為2%制備得到的TiO2納米管(B試樣)生物礦化3天和7天后EDS能譜結果見圖5。Ca，P和O峰很強，說明樣品表面CaP鹽的沉積物厚度較大，已經掩蓋了基底TiO2的信號。礦化3天和7天后B試樣表面通過EDS能譜估算得到的Ca/P比分別為1.58和1.68，接近于羥基磷灰石(HA)中1.67的Ca/P比，推測各樣品表面的沉積物主要是以HA為主的CaP鹽。

圖5 B試樣(2%H2O)生物礦化3天(a)和7天后(b)EDS能譜圖Fig.5 EDS spectra of B sample(2%H2O) mineralized 3 days(a) and 7 days(b)

圖6為不同H2O含量下陽極氧化樣品生物礦化3天和7天后的XRD譜圖。可以看出，每組樣品中都檢測到銳鈦礦TiO2和HA的衍射峰，說明生物礦化后納米管表面的沉積物主要為HA。

圖6 礦化3天和7天后試樣表面的XRD譜圖(a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.6 XRD patterns of the samples surface mineralized for 3 days and 7 days(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

圖7 生物礦化后試樣增重及增重速率Fig.7 Mass gain and mass gain rate of the samples mineralization

圖8是在波長為280nm條件下利用朗伯比爾定律測得的各試樣24h牛血清白蛋白(BSA)吸收曲線，Blank為空白對照組。蛋白吸附是一個動態平衡的過程，即在吸附的同時存在蛋白質的脫附。在初始的2h內，各試樣蛋白吸附量幾乎與時間呈線性增加，并在2h左右達到吸附初期的最大值。隨著時間的增加，脫吸附速率逐漸增加，并在4h左右超過吸附速率，造成試樣表面吸附的蛋白量有所下降，最后吸附和脫吸附過程在6h左右達到初步平衡，經過24h的恒溫放置，蛋白的吸附與脫落達到最終平衡。蛋白吸附量由多到少依次為：B>A>C>D>Ti，具有(001)晶面最高比例的B組的蛋白吸附量最多。

圖8 試樣在BSA中24h的吸附曲線Fig.8 Adsorption curves of samples after soakingin BSA solution for 24h

圖9 蛋白吸附后的試樣表面FT-IR譜圖Fig.9 FT-IR spectra of the sample surfaces after protein adsorption

綜合各樣蛋白吸附曲線和紅外光譜結果可以發現，(001)晶面優勢取向更為明顯的TiO2納米管樣品能夠促進更多的蛋白質吸附。因此可以認為，暴露更多高活性的(001)晶面能夠對蛋白質的吸附起到積極的促進作用，其相應的樣品則具有更好的生物活性。

3 機理討論

相關文獻報道已經證實，F-作為保護劑可以優先吸附在TiO2(001)晶面族上，降低的表面能可以穩定(001)晶面族并促進其擇優生長[27]。在本實驗中，TiO2(001)晶面族除了受到F-的作用，還受到電解液中H2O含量的影響。一方面，H2O作為一種必需成分在陽極被電解并提供氧與金屬鈦結合，以形成無定形TiO2納米管，H2O含量的增加可以提高TiO2形成速率。另一方面，電解液中H2O電離出的OH-與TiO2結合，二者的大量接觸會使無定形的納米管在退火過程中被破壞，從而阻礙(001)晶面族的形成。綜上所述，F-對(001)晶面的擇優生長起促進作用，而水分子具有雙重作用，即H2O作為氧源可以促進氧化的進程，但隨著H2O含量的增加，使得OH-和TiO2大量接觸又抑制TiO2形成特定(001)晶面。在本實驗條件下，2%H2O樣品中銳鈦礦TiO2具有相對較高的(001)晶面比例。

(001)優勢晶面的銳鈦礦具有較高的反應活性，主要有兩個原因：(1) (001)晶面的Ti—O—Ti鍵角(約120.5°)比(101)晶面的Ti—O—Ti鍵角大得多(圖10)；(2) (001)晶面比(101)晶面的原子密度大(圖11)，可以提供更多的不飽和Ti原子，進而與OH-形成Ti—OH基團，而Ti—OH基團則是TiO2生物活性的關鍵物種，一般來說樣品表面Ti—OH基團密度越大，其生物活性越好。因此(001)優勢晶面能夠促進HA的礦化沉積，并提高表面蛋白質的吸附量。

圖10 銳鈦礦TiO2球棍模型示意圖(a)(001)晶面；(b)(101)晶面Fig.10 Schematic diagrams of ball stick model for anatase TiO2(a)(001) facet;(b)(101) facet

圖11 銳鈦礦TiO2的晶體結構Fig.11 Crystal structure of anatase TiO2

4 結論

(1)利用二次陽極氧化法，在金屬鈦表面制備得到高度有序的TiO2納米管陣列，通過控制電解液中H2O含量可以對TiO2中高活性的(001)晶面族占比進行可控調節。

(2)2%H2O得到的TiO2納米管中(001)晶面族擇優取向最明顯，銳鈦礦TiO2(004)晶面的織構系數Tc(004)可達4.76。

(3)生物礦化和蛋白吸附實驗結果表明，得益于(001)晶面族更高的化學活性，具有更高比例(001)晶面族的樣品具有更高礦化沉積速率，并有利于生物礦化進程，還可以增加材料表面蛋白吸附量，體現出更為優異的生物學活性。