不同溫度下無乳鏈球菌感染羅非魚死亡率及各組織HSP70 基因表達研究

蘇乾蓮 趙 武 周 恒 李 斌 梁家幸 何 穎 李曉玉 秦毅斌 盧冰霞 韋明松*

1.廣西獸醫研究所/ 廣西獸醫生物技術重點實驗室，南寧530001；2.廣西畜牧研究所，南寧530001；3.廣西大學動物科學技術學院，南寧530005

羅非魚是我國出口量最大的養殖魚類，2012年我國羅非魚養殖總產量為155 萬t，出口量為36 萬t，總產量和出口量穩居全球第1 位。羅非魚一直被認為易養且抗病力強，但近年來羅非魚病害頻繁發生且日趨嚴重，尤其是無乳鏈球菌病嚴重威脅著羅非魚養殖業的健康發展[1]。水溫變化能引起鏈球菌基因表達差異，最終導致病原菌形態、代謝和毒力的改變[2]。研究表明[3]，水溫高于32 ℃時，羅非魚更易感染無乳鏈球菌。HSP70 是HSP 家族主要成員之一，HSP70 在正常細胞中水平較低，且高度保守，在應激狀態下顯著升高, 可作為應激反應和評價組織細胞處于危險狀態的分子生物標志，因此已成為HSP 中被關注的焦點[4]。熱、冷、低氧、氧自由基、某些細菌及寄生蟲感染等應激因素均可誘導細胞HSP70 的表達，導致核蛋白變性、疏水區暴露并相互作用而聚合，此時，HSP70 從細胞質迅速轉移到細胞核，與變性蛋白疏水區結合，從而限制了其相互聚合，并可使已聚合的蛋白解聚，恢復正常結構，發揮細胞保護作用。當然，如果綜合應激強度過大，造成細胞的膜結構損傷和蛋白質結構改變，不但使HSP70 表達合成降低，而且會使HSP70 在細胞內的分布改變。因此，就無乳鏈球菌在夏季高水溫條件下感染羅非魚過程中HSP70 所發揮的重要作用進行研究，對于弄清為何在高溫時期羅非魚無乳鏈球菌病較常溫時期更嚴重的現象十分必要，同時對于制定合理控制無乳鏈球菌病的策略具有重要意義。在壓力環境中，基礎HSP70 水平的增加可能與個體健康狀況降低有關[5]。HSP 的誘導和適應性的這種關聯已經被證明在發育、生長和繁殖的特征上[6-8]。熱休克蛋白（HSPs）的分子家族在實驗室應激條件下在爪蟾和果蠅等模式生物中已經得到深入研究[9]，特別是70 ku（HSP70）家族，正常（非應激）條件下在細胞中組成性表達，并起到分子伴侶的作用，以防止其他蛋白質形成不適當的聚集。除此功能外，HSP還參與應激細胞和生物體的一般保護[10]。許多研究報告指出，有機體暴露于諸如極端溫度、污染物、缺氧、寄生、捕食或競爭等各種壓力源中，都會引起HSP70 表達的可逆增加，從而保護有機體免受細胞損傷[11-14]。HSP70 在魚類適應鹽度變化中的作用在試驗上也有很好的記載[15-16]。在銀海鯛中，HSP70 的鰓部表達隨著低滲透或高滲透性休克而增加[17]。HSP70 在羅非魚鏈球菌感染的免疫反應中具有重要作用，王瑞等[18]研究顯示無乳鏈球菌在正常水溫下感染羅非魚，24 h 后HSP70 mRNA 表達量是正常脾臟組織的5.5 倍多。在常溫下，HSP70 在抗細菌感染方面發揮重要功能，但在高溫下，HSP70 在抗細菌感染過程中的重要功能還罕見詳細報道。本試驗以尼羅羅非魚（O.niloticus）為例，對其生長最適水溫和高溫應激下無乳鏈球菌感染后的魚體死亡率以及在不同感染時間下HSP70 基因表達情況變化進行研究，探討不同水溫對尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌引起發病的基因表達機制，以期了解和掌握尼羅羅非魚的免疫防御機制。

1 材料與方法

1.1 菌株和羅非魚

1）試驗菌株分離自廣西某養殖場，并經回歸感染證明具有較強毒力，經生化鑒定及16S rRNA 分子鑒定，確定該菌為無乳鏈球菌，保存于廣西水產科學研究院廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室-70 ℃超低溫冰箱。

2）尼羅羅非魚購自廣西某養殖場，魚體質量為（100±10） g，人工感染試驗前，在實驗室分別于28 ℃和35 ℃水溫下暫養7 d，養殖玻璃缸體積為50 L，按常規飼養方法管理，每天換水1/4 體積。

1.2 試劑和試劑盒

引物由安徽通用生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 人工感染試驗

從-70 ℃冰箱取出無乳鏈球菌接種于腦心浸液（BHI）液體培養基中，于搖床28 ℃過夜培養后，菌液以3 000 r/min 離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌3 次，細菌計數板10 倍梯度稀釋進行細菌計數，并配成濃度為1×109CFU/mL 的菌懸液。半數致死量（LD50）的確定：參考祝璟琳等[19]的半數致死量進行驗證，確定無乳鏈球菌的半致死濃度為1.5×108CFU/mL。

表1 定量PCR 引物序列

1）LD50攻毒試驗：將60 尾羅非魚在28 ℃和35 ℃養殖，試驗組和對照組各15 尾，取1.5×108CFU/mL 的無乳鏈球菌0.1 mL 進行腹腔注射，15 尾魚體感染后于0（攻毒前）、24、48、96、120 h 觀察羅非魚的累計死亡情況。

2）1/3LD50攻毒試驗：將30 尾羅非魚在35 ℃養殖，試驗組和對照組各15 尾，試驗組取5×107CFU/mL 的無乳鏈球菌0.1 mL 進行腹腔注射，感染后于0（攻毒前）、24、48、96、120 h 分別從每個養殖桶中取3 尾魚，取尼羅羅非魚鰓、肝臟、脾臟和腸道切成大小為100 mg 的小塊，放在-70 ℃冰箱備用或立即進行組織中HSP70 mRNA 和蛋白表達水平的檢測。

1.4 定量PCR 試驗

提取組織總RNA，采用Rever Tra Ace qPCR RT Kit 試劑盒，把RNA 在65 ℃下熱變性5 min后，立即放冰上冷卻，加入反應體系中的其他成分，反應體系10 μL，反應液組成見表2。

表2 反應液組成

反應條件：37℃、15 min，70 ℃、5min。放-20 ℃冰箱保存，進行Realtime PCR 反應時，將其作為模板直接或稀釋后加入。

應用SYBR Rremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）TaKaRa 試劑盒，熒光定量PCR 反應體系（反應在冰上進行）見表3。

表3 反應體系組成成分

反應條件分3 步：①預變性（1 個循環）：95 ℃，30 s；②PCR 反應（40 個循環）：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s；③熔解曲線（1 個循環）：60～95 ℃。

用ddH2O 來代替cDNA 作為陰性對照，用看家基因beta-actin 作為實時熒光定量PCR 反應的內參。采用相對定量法得出各個樣本△Ct 值（目的基因Ct 值- 內參基因Ct 值），應用2-△△Ct法來計算基因表達水平。

1.5 數據分析

數據用Excel 2003 進行初步處理，再用SPSS 18.0 進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比較（Duncan 氏法）檢驗差異性，P＜0.05 表明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同水溫對尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后累計死亡率的影響

人工感染后，28 ℃和35 ℃水溫下的瀕死尼羅羅非魚都不同程度地表現出無乳鏈球菌引起的典型癥狀，如游姿失衡，打轉，角膜混濁，鰭條基部充血，一些魚表現出突眼癥狀，解剖后發現肝臟、脾臟充血，膽囊腫大等。感染后瀕死尼羅羅非魚體內分離的細菌經API 20 Strep 鑒定為無乳鏈球菌。LD50攻毒試驗中（表4），28 ℃組試驗尼羅羅非魚在感染后48 h 內沒有死亡，感染120 h 的累計死亡率為20%（3 尾）；而35 ℃組試驗尼羅羅非魚在感染24 h 后累計死亡率就達到13.3%（2 尾），之后一直顯著高于28 ℃組，在感染120 h 后累計死亡率達到53.3%（8 尾）。

2.2 無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚HSP70 mRNA 表達的影響（28 ℃）

在28 ℃水溫下飼養尼羅羅非魚，人工感染無乳鏈球菌（1/3LD50）后，在24、48、72、96、120 h 分別取尼羅羅非魚的肝、腸、鰓和脾組織進行熒光定量PCR 檢測，結果見圖1。

表4 28 ℃和35 ℃水溫下不同時間點魚的累計死亡情況 尾

1）各組魚肝臟中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著（P＜0.05，下同）；48 h 和24 h相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h相比，差異不顯著（P＞0.05，下同）。

2）各組魚腸中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

3）各組魚鰓中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著，且24 h 的表達量為最高；48 h 和24 h 相比，表達量顯著降低，差異顯著；72 h 和48 h相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量差異不顯著；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

4）各組魚脾臟中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

2.3 無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚HSP70 mRNA 表達的影響（35 ℃）

在35 ℃水溫下飼養尼羅羅非魚，人工感染無乳鏈球菌后，在24、48、72、96、120 h 分別取尼羅羅非魚的肝、腸、鰓和脾組織進行熒光定量PCR 檢測，結果見圖2。

圖1 不同感染組織熒光定量PCR 檢測結果（28 ℃）

1）各組魚肝臟中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

2）各組魚腸中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

圖2 不同感染組織熒光定量PCR 檢測結果（35 ℃）

3）各組魚鰓中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著，且24 h 的表達量為最高；48 h和24 h 相比，表達量顯著降低，差異顯著；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量差異不顯著；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

4）各組魚脾臟中，HSP70 基因的表達量隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢。24 h 和0 h 相比，表達量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達量升高，差異顯著，且48 h 的表達量為最高；72 h 和48 h 相比，表達顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

3 討 論

水溫是影響魚類生長的重要環境因子，隨著水溫升高，魚的活動和攝食量增加，但當溫度超過魚體最適溫度后，魚的生長隨著水溫的升高反而受到抑制。羅非魚正常發育與生長的溫度范圍是20～35 ℃，最適生長溫度一般為29～31 ℃[20]。無乳鏈球菌是影響魚類健康的重要病原，在水溫高于26 ℃才會發生，而水溫高于32 ℃時，魚類更容易暴發無乳鏈球菌病，在水溫33 ℃時累計死亡率比30 ℃時更高[21]，這可能與無乳鏈球菌等細菌在接近37 ℃時更容易生長相關。劉志剛等[22]研究表明，無乳鏈球菌對羅非魚的毒力與溫度的變化相關，原因是溫度參與了無乳鏈球菌毒力基因的表達調控，如促進無乳鏈球菌生長、黏附、轉移和侵襲相關基因的表達。Kayansamruaj 等[23]研究表明，羅非魚分別在35 ℃和29 ℃水溫中感染無乳鏈球菌后，前者的溶血能力是后者的5 倍；相應地，無乳鏈球菌的毒力基因和炎性基因的表達也顯著上調，死亡率也顯著增加。本研究結果表明，在相同無乳鏈球菌量感染羅非魚的條件下，水溫35 ℃時，尼羅羅非魚累計死亡率比28 ℃時更高，這一結果和前人的研究結果一致。說明溫度應激是影響無乳鏈球菌致病性的重要因素，高溫抑制了魚體免疫系統，同時有利于病原菌的生長繁殖，有利于病原菌毒力基因的表達，降低了羅非魚對病原菌的抵抗力[24]。

研究結果表明，無乳鏈球菌感染能引起感染部位HSP70 基因先升高后降低的趨勢，96 h 和120、0 h相比，差異不顯著。這說明熱休克蛋白的大量表達有助于維持細胞內穩態，改善細胞的生存能力和提高對環境脅迫或傷害的耐受性。鰓中的HSP70 mRNA 在24 h 就達到最高值，而肝脾腸道中是48 h 才達到最高值。這可能是因為鰓暴露在水中，更容易接觸到細菌，更加容易引起感染，感染后mRNA 表達開始上升。

4 結 論

水溫35 ℃組無乳鏈球菌感染的羅非魚累計死亡率顯著高于28 ℃組，水溫28 ℃組和35 ℃組的HSP70 基因的表達變化趨勢一致。無乳鏈球菌感染，能引起感染部位HSP70 基因表達先升高后降低的趨勢。鰓中的HSP70 mRNA 在24 h 就達到最高值，說明鰓更加容易引起細菌感染。