谷氨酰胺對多囊卵巢綜合征大鼠氧化應激相關指標的調節作用

胡雪，吳庚香，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性常見的內分泌及代謝紊亂性疾病，臨床表現為月經稀發或閉經、不孕、多毛、痤瘡，常伴有腹型肥胖和胰島素抵抗，遠期可有糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征等并發癥，嚴重影響女性身心健康。PCOS的病因和發病機制至今尚不清楚，近年來研究發現，氧化應激反應和慢性炎癥反應與PCOS的發病機制密切相關。谷氨酰胺(Gln)是人體含量最為豐富的游離氨基酸和重要的氮運載體和供體，能被氧化釋放能量，在體內參與能量代謝、生物合成、抗氧化及細胞信號轉導等生理過程[1]，常作為一種腸內營養物在臨床中廣泛應用。本研究對PCOS大鼠模型給予Gln干預，通過檢測大鼠體內氧化應激指標變化，探討Gln對PCOS大鼠體內氧化應激水平的調節作用，以期為PCOS的治療提供新的途徑。

材料與方法

一、實驗動物與分組

30只21日齡未成年雌性SD大鼠，購自武漢大學實驗動物中心，隨機分為對照組、PCOS組、PCOS+Gln組，每組各10只，各組大鼠分籠編號喂養。

二、主要試劑及器材

脫氫表雄酮(上海阿拉丁試劑有限公司)；丙氨酰谷氨酰胺注射液(北京雙鶴藥業股份有限公司)；激素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；氧化應激指標生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)；酶標儀(Biotek，美國)

三、研究方法

1.動物模型構建：SD大鼠PCOS動物模型構建參考Di等[2]的研究，方法如下：所有大鼠均于21日齡斷乳，進食普通飼料，自由飲水，適應性喂養2 d，自23日齡起，PCOS組及PCOS+Gln組每日18：30～20：00頸部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)60 mg/kg(溶于0.2 ml橄欖油)，對照組每日頸部皮下注射等量橄欖油，連續注射20 d。造模完成后次日晨8：00，PCOS+Gln組腹腔注射谷氨酰胺0.75 g/kg，方法參考Kim等[3]的方法，PCOS組及對照組腹腔注射等量生理鹽水，12：00各組大鼠再次給予相同處理，當日20：00起所有大鼠禁食12 h后，斷尾采血，吸入異氟烷麻醉，下腔靜脈采血及取雙側卵巢組織，血液離心取血清保存于-80℃，一側卵巢組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，另一側卵巢組織保存于-80℃。

2.血清激素、胰島素和空腹血糖測定：血糖測定取尾靜脈血，血糖儀檢測隨機血糖，下腔靜脈血檢測睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)，胰島素(INS)，按ELISA試劑盒說明書進行操作，簡單介紹如下：用碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/ml，在聚苯乙烯酶標板的每孔加100 μl，4℃過夜進行包被，每孔加入封閉液并洗滌。加適當稀釋的待檢樣品100 μl于已包被的反應孔中，同時做空白孔和倍比稀釋的標準品孔，封板膜封板后置37℃孵育1～2 h，于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl，37℃孵育1 h，洗滌后于各孔中加稀釋好的酶結合物工作液100 μl，37℃避光孵育30 min，于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反應10～30 min，直到倍比稀釋的標準品孔出現明顯的顏色梯度為止。于各反應孔中加入2 M硫酸100 μl終止反應，在酶標儀上，于450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔吸光度值，根據標準品的濃度和OD值做標準曲線，然后根據標準曲線方程計算出樣本濃度。

3.血清氧化應激水平測定：氧化應激指標包括超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)，參照各自相應的生化試劑盒進行檢測，設置空白管、標準管和測定管，分別按說明書加入相應的試劑和顯色劑，最后用酶標儀測定各管吸光度值并計算樣品各指標的含量。

四、統計學分析

結 果

一、各組大鼠卵巢組織學觀察

各組大鼠卵巢組織HE染色結果顯示對照組大鼠卵巢可見不同發育階段的卵泡及多個黃體形成，卵泡顆粒細胞層較多，成熟卵泡內有卵母細胞和放射冠，而PCOS組和PCOS+Gln組大鼠卵巢表面見較多囊性擴張的卵泡，卵泡膜細胞增生，顆粒細胞層明顯減少，卵泡內無卵母細胞和放射冠，較少有黃體形成(圖1)。

圖1 各組大鼠卵巢HE染色×100

二、血清激素及代謝指標檢測結果

與對照組相比，PCOS組和PCOS+Gln組大鼠血清睪酮、黃體生成素濃度均明顯升高，僅PCOS+Gln組大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平顯著升高 (P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+Gln組大鼠血清睪酮、空腹胰島素和空腹血糖顯著升高 (P<0.05)(表1)。

三、血清氧化應激指標檢測結果

與對照組相比，PCOS組大鼠血清MDA、NO和NOS濃度均顯著升高，SOD濃度顯著下降 (P均<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+Gln組大鼠血清MDA、NO和NOS濃度均顯著下降，而SOD濃度顯著升高(P均<0.05)(圖2)。

表1 各組大鼠血清激素及代謝指標濃度的比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCOS組比較，#P<0.05

與對照組比較，*P<0.05；與PCOS組比較，**P<0.05圖2 各組大鼠血清氧化應激水平的比較

討 論

由于PCOS的病因不清，目前對于PCOS患者的治療并不能根治，主要是抗雄激素、增加胰島素敏感性、促進排卵和預防遠期并發癥。Gln雖然在臨床應用廣泛，但在生殖內分泌疾病中應用極少，因PCOS發病與氧化應激反應密切相關，而Gln具有抗氧化作用，本研究首次將Gln應用于PCOS大鼠模型，具有創新性和新穎性。PCOS動物模型構建方法有多種，本研究中采用簡便、可行性高的連續皮下注射DHEA方法構建PCOS大鼠模型，結果顯示在DHEA誘導下SD雌性大鼠的卵巢組織呈現多囊樣改變，并且內分泌改變也與PCOS患者相似，再次證明了這種造模方法的穩定性，為本研究檢測各組大鼠體內氧化應激水平變化及給予Glu干預結果的準確性奠定了基礎。

機體在生理狀態下，氧化與抗氧化反應處于動態平衡中，而當機體活性自由基產生過多或抗氧化能力降低，氧化還原過程失衡，則會發生病理反應，引起糖化氧化作用、脂質氧化損傷、蛋白質過氧化反應以及DNA損傷，導致細胞凋亡、組織器官損害和疾病的發生[4]。NO是一種活性氮，參與氧化反應；NOS能提高NO的含量和活性；MDA是脂質氧化終產物，反映了細胞膜受損程度；SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，具有抗氧化作用。大量研究[5-6]表明，PCOS患者體內氧化與抗氧化失衡，PCOS患者血清及動物模型卵巢組織均存在MDA水平增高和SOD水平降低的現象，本研究中，DHEA誘導的PCOS大鼠血清MDA水平較對照組升高，SOD水平較對照組降低，與上述研究結果相同。PCOS患者體內NO水平變化觀點不一[7-8]，本研究結果顯示與劉廣南等[7]研究一致，PCOS大鼠體內NO及NOS水平升高。氧化應激與PCOS的胰島素抵抗、高雄激素血癥、不孕等均有密切聯系[9-10]，對PCOS的發生發展有重要影響，還可能影響PCOS患者行體外受精-胚胎移植的臨床結局[11]，張丹等[12]發現對PCOS患者用炔雌醇環丙孕酮片聯合維生素C及維生素E(抗氧化劑)口服治療3個月后，MDA水平下降，而SOD水平升高，且聯合治療組的PCOS患者月經恢復情況也比單用炔雌醇環丙孕酮片理想。

Gln是一類人體非必需氨基酸，有改善疾病預后，提高免疫力的作用[13]。其作為抗氧化物谷胱甘肽的前體，可以提高體內谷胱甘肽的水平，增強氧化防御功能，減輕氧化反應和炎癥反應；還可以通過誘導熱休克蛋白70的表達及抑制細胞凋亡，發揮抗氧化效能[14-15]。Gln在各種疾病導致的急危重癥、胃腸手術后、燒傷創傷及腫瘤等疾病中應用廣泛，但在生殖內分泌相關疾病中極少應用。本研究對PCOS大鼠給予Gln短期治療后，血清MDA、NO、NOS水平顯著降低，而SOD水平明顯升高，證明Gln對PCOS大鼠體內的氧化應激水平也有調節作用。抗氧化劑中藥在提高PCOS大鼠體內抗氧化能力的同時，可改善PCOS大鼠胰島素抵抗和高雄激素血癥[7]，并且Mansour等[16]對2型糖尿病患者連續給予Gln 6周后發現其能降低空腹血糖和胰島素，然而本研究結果顯示Gln對PCOS大鼠體內的睪酮、空腹血糖、胰島素水平并沒有改善作用，這可能與本研究Gln干預時間較短、樣本量少相關。

綜上所述，PCOS大鼠體內氧化與抗氧化失衡，氧化應激指標升高，抗氧化指標下降，給予Gln干預能顯著降低MDA、NO、NOS水平、顯著升高SOD水平，減輕PCOS大鼠體內氧化應激反應，為PCOS的治療提供了新的途徑。本研究的缺點在于Gln干預的時間較短、導致內分泌和代謝情況不能準確評價，并且對于Gln干預后的PCOS大鼠遠期并發癥情況沒有檢測相關指標，因此本課題組在后期的研究中會針對這些問題進行改進，以期獲得更全面更準確的結果，為PCOS的治療提供可靠的依據。