印度梨形孢對文心蘭組培苗生長的影響

劉慧春，李明江，金亮，田丹青，朱開元，張加強，周江華，譚晨

(浙江省農業科學院 花卉研究開發中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢真菌(Piriformosporaindica)首次發現于印度西北部的塔爾沙漠[1]，是一種可與植物共生的真菌，其典型特征是厚垣孢子為梨形[2]。依據該真菌的形態特征和其18S rRNA序列在Genebank中的比對結果可知，該真菌在分類上屬于擔子菌門傘菌綱蠟殼耳目蠟殼耳科梨形孢屬。印度梨形孢與從枝菌根真菌在形態和生理特征上非常相似，均與植物共生，其最大差別在于，枝菌根真菌無法在人工合成的培養基上進行培養，而印度梨形孢可在人工培養基上繼代繁殖[3]。

印度梨形孢可接種于多種植物根部，包括雙子葉植物擬南芥、小白菜、油菜和單子葉植物大麥、水稻、玉米、文心蘭等[4-10]。印度梨形孢與植物產生共生關系后，可以促進植物生長，增加植物生物量，植株抗氧化能力增強，并誘導植物產生系統抗性等[11-13]。此外有研究發現，大麥感染印度梨形孢真菌后，生長素合成、轉運相關基因表達上調，印度梨形孢可能通過生長素的合成、運輸調節植物地上部生長和根發育[14]。

本研究將印度梨形孢應用于觀賞植物文心蘭(Oncidiumorchid)中，建立了有效的印度梨形孢和文心蘭的接種系統，發現印度梨形孢菌絲可以穿入文心蘭根部的表皮層細胞，促進根部的生長和加粗，對文心蘭地上部生長也有明顯的促進作用。

1 材料方法

1.1 供試材料

供試材料為文心蘭切花品種南西，生長于浙江省農業科學院花卉研究開發中心組培室中；供試印度梨形孢菌株由臺灣大學葉開溫教授惠贈。

1.2 培養方法

文心蘭。在組培瓶中采用1/2MS培養基無菌培養文心蘭小苗，待小苗高3～5 cm，有1～3個根時接入改良的G10培養基(1 L溶液中含有MS粉3.46 g，馬鈴薯200 g，瓊脂10 g，蔗糖20 g，pH值5.7～5.8)培養2周。培養條件為20～28 ℃光照培養16 h，18～23 ℃黑暗培養8 h。

印度梨形孢。將印度梨形孢菌絲塊接種于PDA培養基(1 L溶液中含有馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 g)上，石蠟膜封口，28 ℃黑暗培養1周后備用。

共培養。將上述培養好的印度梨形孢菌塊接種于文心蘭組培瓶中，距離文心蘭根部0.5～2 cm，培養條件為20～28 ℃光照培養16 h，18～23 ℃黑暗培養8 h。

共培養20 d左右更換培養基進行繼代培養，繼代培養中不需要再加入菌塊，文心蘭根部攜帶的真菌可作為菌種進行共培養。

1.3 石蠟切片觀察

根解剖結構的觀察參照李正理[15]石蠟切片法。

2 結果與分析

2.1 共培養體系的建立

供試材料文心蘭切花品種南西的組織培養生根小苗所用培養基為1/2MS，印度梨形孢繼代培養基為PDA培養基。通過前期試驗發現，將印度梨形孢接入1/2MS后，真菌生長緩慢，培養5 d后仍未見明顯生長。為建立印度梨形孢與文心蘭的共培養體系，對文心蘭所用1/2MS培養基進行改良，加入馬鈴薯汁形成G10培養基，觀察文心蘭和真菌在此培養基上的生長。結果表明，文心蘭在G10培養基上生長發育正常；印度梨形孢在G10培養基上生長良好，生長速度與在PDA培養基上接近，菌絲和孢子均生長正常(圖1)。

把文心蘭組織培養小苗接入G10培養基，生長約2周后，用印度梨形孢菌絲塊接種文心蘭小苗，菌塊放置于根部約0.5 cm處，進行真菌和幼苗的共培養。約20 d后，印度梨形孢真菌可長滿整個培養基。此時觀察發現，共培養的文心蘭植株開始萌發新的氣生根，且比侵染前的根要粗壯。為避免菌絲的過量生長對植物生長帶來抑制，在共培養20 d后，將共培養和對照植株均接入新的G10培養基進行繼代培養，繼代培養的植株不再接入新的菌塊，根部攜帶的真菌可在20 d左右鋪滿新的培養基，達到共培養的目的。

2.2 印度梨形孢對文心蘭根部的侵染

為檢測印度梨形孢對文心蘭根部的侵染狀況，對印度梨形孢共培養植株的根做了石蠟切片。顯微鏡下觀察發現，印度梨形孢可定殖于文心蘭的根部。從圖2可以看出，印度梨形孢菌絲可以成功侵入文心蘭根部的表皮層，并在表皮細胞內部延伸擴展。從圖3可以看出，印度梨形孢的侵染和在根部的定殖造成了文心蘭根部表皮層細胞的膨大，由于這層細胞的膨大造成了共培養植株根的加粗。

圖1 印度梨形孢在G10和PDA培養基上培養5 d后的生長狀況

RC，表皮層。20×、40×、100×代表顯微鏡不同倍數；CC，維管柱；C，皮層；RC，表皮層圖2 印度梨形孢菌絲對植株根部表皮層的侵染狀況

CC，維管柱；C，皮層；RC，表皮層圖3 印度梨形孢共培養植株和對照植株的根縱切面比較

2.3 印度梨形孢對文心蘭的促生作用

共培養50 d后，將對照植株和共培養植株出瓶，對共培養植株和對照植株的生物量進行觀察和測定。從圖4可以看出，印度梨形孢共培養對文心蘭植株的生長有明顯的促進作用，株高、根的數量上明顯高于對照；從表1可以看出，共培養植株的株高比對照增加70%左右，鮮重增加96%左右。共培養植株的根的數量明顯增加，根總長度是對照的2.4倍。

圖4 印度梨形孢共培養植株的表型觀察

表1 印度梨形孢共培養植株的生長促進狀況

3 討論

真菌培養常用的培養基有PDA、CZA等，植物組織培養多用MS、1/2MS培養基，不同培養基的分離真菌效果不同[16-17]。在本研究中，印度梨形孢真菌在1/2MS培養基中生長緩慢，但在加有土豆的G10培養基中，其生長就能像在PDA真菌培養基中一樣正常。這可能源于印度梨形孢是寄生菌，需要從寄主植物吸收營養元素才能更好地生長，加有土豆的培養基剛好可以提供印度梨形孢所需的營養元素。1/2MS培養基中主要成分是碳源和糖，不能有效供給印度梨形孢所需的營養需求，所以生長緩慢。

本研究發現，印度梨形孢可很好地與文心蘭共生，其菌絲定殖在文心蘭根部表皮層，并通過表皮細胞的擴增使得根部加粗，這一現象非常符合印度梨形孢的特性，即印度梨形孢與植物共生后菌絲僅在根系表面、根系表皮細胞之間和根系表皮細胞內部擴展[18]。據報道，印度梨形孢不僅能夠與多數植物共生[19]，而且還能促進植物的生長發育，這可能與赤霉素有關[10,14]。印度梨形孢定殖于寄主植物根部，通過分泌生長素來促進植物根系生長，從而加快根系對營養物質的吸收，最終達到對寄主植物的促生作用[20-25]。由此推測，印度梨形孢對文心蘭的促生作用，與印度梨形孢感染文心蘭后提高了寄主植物根系赤霉素的含量有關。

綜上所述，印度梨形孢可與文心蘭共生，菌絲定殖于文心蘭根部表皮層，能提高根系的數量和長度，促進文心蘭植株地上部分的生長。后續有待進一步研究印度梨形孢對文心蘭的促生、抗逆作用，并有望將印度梨形孢應用于文心蘭組培苗煉苗、種苗繁育、栽培、育種等方面。