藍莓葉片的培養試驗

王建萍，李公存，沙玉芬，顧亮，劉笑宏，蘇佳明

(煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265500)

藍莓屬杜鵑花科越橘屬植物，原產于北美和東亞，是世界上少見的真正藍色漿果[1]。藍莓果實中含有較多的花色素苷、黃酮等生理活性成分，具有防止腦神經衰老、增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效[2]，是近年許多國家發展十分迅速的優良果樹之一，尤其是歐美國家[3-4]。我國對藍莓的應用可追溯到20世紀50年代，東北地區的篤斯藍莓被用來釀酒[5]。20世紀80年代，吉林農業大學郝瑞教授最先率隊對長白山地區的野生篤斯藍莓資源進行全面系統的調查研究，并開始野生藍莓的馴化栽培工作[6]。到2017年我國藍莓栽培面積達到5.59萬hm2，總產量15.43萬t[7]，目前我國藍莓栽培面積和產量列居全球第四位[8]。當前制約藍莓產業發展的一個重要原因是育種周期長的問題，常規的育苗方法不能滿足發展需求，而通過組織培養和脫毒技術可以獲得比常規育苗更大量、更優質的種苗，滿足市場上對藍莓種苗的需求。本研究以藍莓品種杜克和布里吉塔葉片為外植體，研究藍莓葉片離體再生技術，旨在探討藍莓工廠化育苗技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

Cao等[9]研究發現，不同藍莓品種葉片再生頻率不同。本試驗以繼代培養的杜克和布里吉塔2個藍莓品種試管苗為試驗材料，由煙臺農科院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得

4月取當年生無病蟲害生長健壯的枝條，摘除葉片后放入加水的容器中，于0～4 ℃條件下冷藏2～3 d，接種前，用洗潔精將枝條洗刷干凈，剪成3～4 cm的莖段，流水沖洗30 min，然后在超凈工作臺上將剪好的莖段用乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1次，然后用0.1%的升汞溶液浸泡8～12 min(根據枝條老嫩程度)，再用無菌水沖洗4～6次，剪去兩端，接種于誘導培養基上進行培養。生長30 d后轉移到改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1培養基上繼代培養。

1.2.2 葉片不定芽再生

采取繼代培養30～35 d的試管苗中上部大小一致的幼嫩葉片，剪成0.3 cm見方，近軸面向下接種到預先配置好的培養基上，每個配方培養基上接種120片。以TDZ(一種新型植物生長調節劑，具有很強的細胞分裂素活性，可以促進植物芽的再生和繁殖)和ZT(一種細胞分裂素，具有促進細胞分裂、誘導芽的分化等作用)為激素，基本培養基為改良WPM培養基，蔗糖30 g·L-1，瓊脂3.5 g·L-1，pH值為5.0～5.2。進行不同時間的暗培養，后轉為光照培養。光照強度1 500～2 000 lx，光照時間14 h·d-1，培養溫度(25±1)℃，空氣相對濕度40%～70%。

1.2.3 暗培養

將葉片接種在培養基上，每個配方分成5份，分別置黑暗中培養0、5、10、15、20 d，后轉為光照培養。

1.2.4 生根培養

外植體在增殖培養基上生長30 d左右，剪取高2 cm以上的植株接種到不同配方的生根培養基中，基本培養基為1/2改良WPM。

2 結果與分析

2.1 不同TDZ濃度對兩個品種藍莓葉片再生的影響

由表1可以看出，TDZ濃度越低，2個藍莓品種葉片再生效果均越差。當濃度為0.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生頻率分別僅有14.2%和10.0%；當TDZ濃度為2.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生芽葉片數均達到最高，再生頻率分別為65.0%和58.3%。

2.2 不同ZT濃度對兩個品種藍莓葉片再生的影響

由表2可以看出，ZT濃度較低時，2個藍莓品種葉片再生效果較差。當ZT濃度為0.5 mg·L-1時，杜克和布里吉塔再生頻率分別僅為20.0%和15.0%；當ZT濃度為2.0 mg·L-1時，杜克葉片再生效果最好，再生頻率達82.0%，布里吉塔葉片再生效果也較好；當ZT濃度為2.5 mg·L-1時，布里吉塔葉片再生效果最好，再生頻率為65.8%，杜克葉片再生效果也較好，2個品種間差異不大。

2.3 TDZ和ZT搭配使用對藍莓葉片再生的影響

由表3可知，不同配方培養基對杜克藍莓葉片再生效果不同，在5號培養基上葉片再生效果最好，再生頻率達90%；在6號培養基上再生效果較好，再生頻率為66.7%；在2、3、4號培養基上葉片再生效果較差；在1號培養基上再生效果最差，再生頻率僅為16.7%。

表2 不同ZT濃度對兩個藍莓品種葉片再生的影響

布里吉塔在6號培養基上葉片再生效果最好，再生頻率為80%；在5號培養基上再生效果較好，再生頻率為73.3%；在2、3和4號培養基上再生效果較差，在1號培養基上再生效果最差，再生頻率僅為11.7%。

表3 不同培養基配方對藍莓品種葉片再生的影響

2.4 暗培養時間對藍莓品種葉片再生的影響

由表4可知，暗培養20 d，杜克再生芽數最多，再生頻率為76.7%；暗培養15和10 d，再生芽數較高，再生頻率分別為74.2%和62.5%；未經暗培養處理時，再生芽數最低，再生頻率僅為33.3%。

表4 暗培養時間對藍莓品種葉片再生的影響

暗培養15 d，布里吉塔再生芽數最多，再生頻率達83.3%；暗培養20 d，再生芽數也較多，再生頻率為73.3%；未經暗培養處理時，再生芽數最少，再生頻率僅為31.7%。

由此可知，在對杜克和布里吉塔進行葉片培養時，經過一定時間的暗培養可顯著提高葉片的再生頻率和再生芽數。不經過暗培養，葉片雖有再生能力，但再生力較差。

2.5 生根培養

由表5可以看出，杜克在3號培養基上生根率最高，達100%，平均根長最長，為2.3 cm；2號培養基的生根率較高，為91%，平均根長2.1 cm；在1號和5號培養基上生根率較低，分別為37%和53%；在6號培養基上生根率最低，僅有21%，平均根長最短，僅為0.8 cm。

表5 不同培養基兩個藍莓品種不定梢生根情況

布里吉塔在3號培養基上生根率最高，也達到100%，平均根長為2.5 cm；在2號和4號培養基上生根率較高，分別為85%和87%，平均根長分別為2.0和2.1 cm；在1號和6號培養基上生根率均較低，分別僅有21%和17%。

3 小結與討論

本研究表明，TDZ和ZT能較好地誘導杜克和布里吉塔葉片分化。TDZ濃度較低時，2個藍莓品種葉片培養效果較差；隨著濃度的升高，再生芽葉片數及再生頻率明顯升高，表明較高濃度的TDZ有利于藍莓葉片再生；ZT濃度較低時，2個藍莓品種葉片培養效果較差，隨著濃度的升高，再生效果明顯變好，但當濃度達到3.0 mg·L-1時，再生效果變差，說明低濃度和高濃度的ZT均不利于藍莓葉片再生。TDZ和ZT搭配使用明顯好于單獨使用的效果，說明兩者搭配使用有利于藍莓葉片再生。

本研究發現，杜克和布里吉塔葉片再生效果差異不大，這可能與2個品種同屬于北高叢藍莓有關；試驗結果表明，暗培養可明顯提高藍莓葉片不定芽再生能力，暗培養15 d時布里吉塔葉片再生能力最強，暗培養20 d時杜克葉片再生能力最強；結果表明，低濃度和高濃度的IBA均不利于藍莓生根，濃度為1.5 mg·L-1時效果最好，生根率達100%。