有機酸和醇對以浸米水為原料發酵細菌纖維素的影響

曹艷，夏其樂，陳劍兵，單之初，陸勝民*

(1.浙江省農業科學院食品科學研究所農業農村部果品采后處理重點實驗室 浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室浙江 杭州 310021； 2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000)

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是由微生物產生的一類纖維素的統稱，由葡萄糖分子以β-1，4-糖苷鍵聚合而成[1]，其區別于植物纖維的主要特點是具有高持水力、高結晶度、高彈性模量、良好的生物相容性和機械性能等特性[2-3]。由于BC不含熱量、咀嚼性好，目前主要用作食品配料(又稱為納塔)添加在罐頭、果凍、冰淇淋、火腿腸等食品中[2, 4]。目前，生產BC的主要原料是自然發酵的椰子水，產量為10～12 g·L-1(干質量)。但我國椰子年產量只占全世界的0.04%[5]，生產原料不足、生產成本較高制約了我國BC產業的發展。此外，BC也可作為新型材料基質用于醫藥、化工、造紙等領域[6]，使得BC需求量逐年增加，而國內目前所消費的BC幾乎全部靠進口。

浸米水是黃酒釀造過程中的主要副產物之一。我國黃酒年產量200萬t左右，而生產1 t黃酒一般會產生大約0.65 t浸米水，浸米水量大而集中。目前浸米水主要通過沉降處理、上清經曝氣處理后排放[7-8]。在浸米過程中，稻米中的淀粉、蛋白質、維生素等營養物質被浸出，大量乳酸菌和酵母菌在其中繁殖并分解這些營養物質，使得浸米水中含有豐富的糖類、蛋白質、有機酸和氨基酸等營養物質[9]。因此，浸米水如果能被合理利用，即可成為回收利用的資源，而如果被當作廢物棄之就會嚴重污染環境，最終對黃酒產業產生不利影響。

目前，利用其他原料代替椰子水生產BC的研究報道也越來越多，其中以含糖/氮量較高的農副產品加工副產物居多[10-13]。而浸米水外觀與自然發酵的椰子水類似，呈淺黃色或淺棕色，pH在2.0～4.0，聞起來有酸味，且都經過微生物發酵，其中除了碳源、氮源、氨基酸等營養物質外，還含有大量可以被木醋桿菌利用的有機酸和醇類[9, 14]。王志國等[15-17]的研究結果表明，一些小分子有機酸和醇類可促進BC合成。因此，本研究以浸米水為原料，考察了添加不同有機酸和醇類對BC產量的影響，確定了影響以浸米水為原料發酵BC的主要物質因素，為促進國內BC產業發展和實現浸米水提質增效提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

木醋桿菌Gluconacetobacterxylinus，購于微生物菌種保藏中心，保存于-80 ℃冰箱；浸米水取自浙江塔牌紹興酒有限公司，浸米水經沉降過濾后，上清液用于配制BC發酵培養基。

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；WYA-Z自動阿貝折射儀，上海儀電科學儀器有限公司；雷磁PHS-25臺式pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司；生化培養箱，上海博迅實業有限公司；超低溫冰箱，三洋電機國際貿易有限公司。

1.2 培養基及發酵條件

菌種活化培養基。葡萄糖10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，碳酸鈣5 g·L-1，瓊脂粉17 g·L-1，以蒸餾水補足1 L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min，冷卻到50～55 ℃后，傾倒至培養皿中備用。

種子培養基。參考HS培養基[18]。蔗糖20 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.7 g·L-1，檸檬酸1.15 g·L-1，用蒸餾水補足1 L，pH值自然，115 ℃滅菌15 min。100 mL種子培養基裝于250 mL燒杯，30 ℃靜置培養3～4 d。

浸米水基礎發酵培養基。蔗糖30 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，檸檬酸1 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3 g·L-1，FeSO40.05 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，以浸米水補足1 L，pH值自然，115 ℃滅菌15 min。120 mL發酵培養基量裝于300 mL燒杯中，接種量3%～5%，30 ℃靜置培養10 d。接種前向基礎發酵培養基中添加不同種類、濃度的有機酸和醇，考察其對BC產量的影響。

1.3 測定方法

1.3.1 pH值和可溶性固形物含量

pH值測定用雷磁PHS-25臺式pH計測定；可溶性固形物含量(°Brix)用WYA-Z自動阿貝折射儀測定[19]。

1.3.2 菌體濃度

向不同發酵時期的發酵培養基中添加100 U·g-1纖維素酶，于45 ℃、100 r·min-1水浴加熱6 h，待BC完全水解后，于600 nm處測定BC水解液和培養基混合液的吸光度(D600)[20]。

1.3.3 BC產量

將發酵所得BC取出后，用水沖洗幾次，除去膜表面培養基及雜質。再將膜浸泡于0.1 mol·L-1的NaOH溶液，80 ℃煮沸20 min，去除BC膜中的菌體和殘留培養基，然后用蒸餾水多次沖洗，直至用pH試紙輕壓膜測pH值為中性。105 ℃干燥至恒質量，BC產量用單位體積培養基所得BC干質量計(g·L-1)。

1.4 數據處理及分析

每個處理均重復測定3次，結果所示數據均為3次平行試驗數據的平均值±標準偏差，采用Excel 2010和SPSS 20.0對數據進行處理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 添加不同有機酸和醇類對BC發酵的影響

在浸米水基礎發酵培養基中添加0.5 g·L-1不同有機酸和醇條件下，BC產量如圖1所示。添加的有機酸和醇均是糖類在微生物體內的代謝產物，因此，它們可直接作為碳源或通過糖異生途徑被木醋桿菌利用。從圖中可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油對BC合成有顯著促進作用，且添加乳酸、乙酸或乙醇條件下BC產量大幅提高；蘋果酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和酒石酸抑制BC合成；丙酮酸和山梨醇對BC合成基本沒有影響。由此可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可作為以浸米水為原料發酵BC的增效因子。

A，對照；B，乳酸；C，乙酸；D，丙酮酸；E，蘋果酸；F，琥珀酸；G，α-酮戊二酸；H，草酰乙酸；I，酒石酸；J，乙醇；K，甘油；L，山梨醇。柱間無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)圖1 添加不同有機酸和醇對以浸米水為原料發酵生產BC的影響

選擇具有代表性的處理組(添加乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、乙醇和甘油)，考察其發酵過程中可溶性固形物含量和菌體濃度變化，如圖2所示。從圖中可以看出，添加丙酮酸條件下，菌體生長和可溶性固形物含量下降趨勢均與對照相差不大，由此可看出，丙酮酸沒有對菌體生長和代謝活性產生影響，最終BC產量也與對照相當。添加乳酸、乙酸或乙醇條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物含量下降速率均比對照顯著提高，且提高幅度較大。添加琥珀酸和甘油條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物下降速率比對照略高，BC產量提高幅度雖然較小，但與對照相比仍有顯著升高。添加α-酮戊二酸條件下，最大菌體濃度和可溶性固形物下降速率均顯著低于對照，表明菌體生長及其代謝活性受到抑制，導致BC合成量下降。

圖2 添加不同有機酸和醇對菌體濃度和可溶性固形物含量的影響

BC合成需要消耗大量能量，乳酸、乙酸和乙醇作為糖酵解途徑的代謝產物，它們可通過氧化生成丙酮酸，參與胞內代謝并產生能量，較多的能量可以促進BC的合成[16, 21-22]。琥珀酸作為三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環的中間代謝產物，額外添加可保證TCA循環的持續正常運行，使胞內能量水平維持在相對穩定的水平，有利于BC合成[23]。甘油可通過糖異生途徑生成丙酮酸，參與BC合成，且不生成葡萄糖酸，胞內底物代謝大部分轉向BC合成[24]。此外，甘油還可作為菌體在逆境中的保護劑，有利于維持菌體較高的代謝活力，有利于BC合成。丙酮酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、草酰乙酸和酒石酸是微生物代謝的中間產物，其胞內含量可能已經能夠維持正常代謝，額外添加反而會擾亂正常的胞內代謝，進而對木醋桿菌生長和BC合成產生不利影響。綜上所述，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可促進菌體內部能量代謝或維持較高的菌體活力，進而促進BC大量合成。

2.2 不同濃度增效因子對BC產量的影響

在浸米水基礎培養基中分別添加不同有機酸類增效因子(乳酸、乙酸和琥珀酸)條件下，BC產量如圖3所示。從圖中可以看出，隨著有機酸濃度的增加，BC產量呈先增加后略微下降的趨勢，當乳酸、乙酸和琥珀酸含量分別在0.6、2.0、1.5 g·L-1時，BC產量最高，且添加乳酸和乙酸條件下BC產量提高幅度高于添加琥珀酸。由此可以看出，乳酸和乙酸比琥珀酸更容易被木醋桿菌利用。Naritomi等[21]和Yang等[22]的研究均表明，乙酸和乳酸不是作為BC合成的底物，而是僅參與能量代謝，為BC合成和維持菌體代謝活性提供能量。琥珀酸作為TCA循環的中間代謝產物，雖然也可被菌體利用，但其在胞內的含量可能已經能夠維持代謝平衡，因此，BC產量沒有隨著其添加量的增加而顯著增加。

圖3 浸米水培養基中添加不同濃度有機酸增效因子對BC產量的影響

在浸米水基礎培養基中添加醇類增效因子(乙醇和甘油)條件下，BC的產量如圖4所示。乙醇和甘油均可以作為碳源被木醋桿菌利用，但乙醇可被直接作為底物利用，而甘油則需要通過復雜的糖異生途徑才能參與到BC合成途徑中[25]。因此，雖然甘油可以作為底物用于BC合成，但有蔗糖存在時并不會作為優先碳源使用。此外，Yunoki等[17]的研究表明，乙醇不作為木醋桿菌合成BC的底物，其進入胞內后首先被氧化成乙酸、參與能量代謝，促進葡萄糖的聚合，提高了葡萄糖合成BC的效率，進而促進BC合成。因此，添加乙醇條件下BC合成量顯著高于添加甘油條件下。

圖4 浸米水培養基中添加不同濃度醇類增效因子對BC產量的影響

在浸米水基礎培養基中將乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油按其最適量添加后，BC最終產量為8.4 g·L-1，雖然低于以椰子水為原料生產BC的水平(11.2 g·L-1)(圖5)，但生產原料更經濟，因此，仍具有一定的工業應用前景。

圖5 浸米水培養基中添加混合增效因子對BC產量的影響

3 小結

本研究通過考察浸米水培養基中添加不同小分子有機酸和醇類對BC產量的影響，明確了對以浸米水為原料發酵BC具有促進作用的增效因子及其最適添加量，即乳酸0.6 g·L-1、乙酸2.0 g·L-1、乙醇20.0 g·L-1、琥珀酸 1.5 g·L-1和甘油2.0 g·L-1。將增效因子按其最適添加量混合加入浸米水培養基中，BC產量比對照提高3.59倍。浸米水是黃酒產業的主要副產物之一，利用浸米水生產BC，可大幅降低黃酒廠超標污水的排放量，且在不增加投入昂貴設備的前提下，實現浸米水提質增效的目的。此外，BC生產原料范圍擴大，可大幅提高BC產量以滿足其需求的上漲，促進我國BC產業發展。