復方中草藥KFJ制劑對感染弧菌病的凡納濱對蝦免疫活性的影響

朱志東，朱宇嘉，呂莉，董碧蓮，蔡延渠，辛年香，朱盛山

(1. 廣東藥科大學新藥研發中心廣東 廣州 510006；2. 廣州普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

聯合國糧農組織指出：弧菌病一直困擾著科學家、動物衛生主管部門和養殖者，很難采取有效的預防和治療措施。據2015年對凡納賓對蝦病害的調查結果，在成蝦樣本中，弧菌病占74.6%，每年因弧菌病造成的經濟損失高達10億美元[1]。目前，控制水產動物弧菌病的主要是用抗生素，不僅效果不明顯，而且導致諸多問題，如藥殘、耐藥、破壞生態平衡、對動物有毒副作用等[2-3]。中草藥為綠色藥物，具有多功效、全面提高免疫力、不易誘發病原菌耐藥性等優勢，對推進水產無公害養殖病害的防治具有重大意義[4]。研究顯示，中草藥能顯著提高水產動物免疫力、抗氧化能力及疾病抵抗力等[5-7]。鑒于此，國內外學者從免疫學角度對蝦病進行防治研究，提高對蝦自身非特異免疫力，以達到增強抗病力的目的[8-9]。該試驗采用復方中草藥KFJ制劑飼喂凡納濱對蝦，抑殺對蝦體內弧菌，通過刺激免疫系統，來提高其防御能力，進而達到治病、防病的目的。試驗通過測定蝦肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性3種非特異免疫酶相關的變化，探討復方中草藥KFJ制劑提高蝦非特異免疫力的效果，為KFJ制劑產品的推廣應用提供基礎數據。

1 試驗材料

1.1 凡納濱對蝦

225萬尾(體長8～10 cm)，廣東省中山市海騰養蝦場提供，養于室內搭棚水泥池(150個，體積58 m3/個，放養蝦苗15 000尾)中，循環水，連續充氧，投喂飼料。

1.2 藥品和儀器

由廣東某研究所提供的復方中草藥KFJ制劑(2 g/mL)。冰箱(海爾，BCD-257SL)；紫外分光光譜儀(MV-1700，島津)；超低溫冰箱；5418R低溫高速離心機；Mulitskan MK3 酶標儀；總抗氧化能力、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶試劑盒。

2 方法

2.1 分組與取樣

2.1.1正常組 從放苗開始，以KFJ制劑與飼料1∶6拌料投喂，連續投喂2 d，1 d 1次，4 d為一個間隔，定期預防，未見發病，為該試驗正常蝦。隨機取正常蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環水，連續充氧；從停喂KFJ制劑第3天開始，分別在第72、75、78、84、96、120和168 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.1.2 感染發病組 已養45 d對蝦，有6個養殖池，開始發病(依據癥狀、弧菌培養，診斷感染弧菌病)。病蝦發病初期活動能力減弱，趴塘，食欲減退，慢料；發病中期出現游塘，浮便，腸道分節；發病后期有偷死、白便、長便、拖便，肝臟開始萎縮，無血色，肝胰臟包膜不完整，甚至消失。

2.1.3 感染發病對照組 隨機取發病初期感染弧菌病蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環水，連續充氧，以正常飼料投喂，分別在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.1.4 感染發病給藥組 隨機取發病初期感染弧菌病蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環水，連續充氧，以復方中草藥KFJ制劑與飼料1∶3拌料投喂，連續投喂2 d，1 d 2次，于投料完畢后分別在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.2 樣品解凍

取冰凍保存的各待測肝胰腺樣品，置于0 ℃水解凍，用以各項肝胰腺指標的測定。

2.3 總抗氧化能力的測定

取各待測肝胰腺上清液樣品0.05 mL和雙蒸水0.05 mL，分別加入K2S2O3緩沖液1 mL，ABTS工作液2 mL和過氧化氫溶液0.5 mL，混合均勻，37 ℃水浴30 min后，分別加入過氧化氫酶溶液0.1 mL，混合均勻，放置10 min，于520 nm處測定各樣品的吸光度，按下式計算各組織樣品的總抗氧化能力。

總抗氧化能力=(測定OD值-對照OD值)/0.01/30×(反應液總液體量/樣本取樣量)×樣本測試前稀釋倍數(單位/毫升組織液)

2.4 酸性磷酸酶的測定

取雙蒸水、0.1 mg/mL酚標準應用液和各待測肝胰腺上清液樣品0.05 mL，分別加入緩沖液和基質液0.5 mL，充分混勻，37 ℃水浴30 min后，分別加入堿液1 mL和顯示劑1.5 mL，立即混勻，室溫靜置10 min，于520 nm處測各待測樣品的吸光度值，按下式計算酸性磷酸酶活性。

2.5 堿性磷酸酶的測定

取雙蒸水、0.1 mg/mL酚標準應用液和各待測肝胰腺上清液樣品0.05 mL，加入0.5 mL 0.1mol/L的硼酸鹽緩沖液、4-氨基安替吡啉基質液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，加入鐵氰化鉀顯色劑1.5 mL，立即混勻，室溫靜置10 min，于520 nm處測各樣品的吸光度值，按下式計算堿性磷酸酶活性。

2.6 統計分析

采用 Excel和SPSS 13.0 軟件對數據進行統計分析。先對數據作單因素方差分析(ANOVA)，處理若有差異統計學意義，再作 Duncan’s 法多重比較，P<0.05表示差異具統計學意義。

3 結果

3.1 癥狀觀察

正常組，蝦活力正常，攝食良好，體色通透，肝臟分明，腸道飽滿，未見有偷死；感染發病對照組，病蝦活動能力逐步減弱，蝦身瘦弱，體色發暗，拖便、食欲減退，慢料、減料，肌肉白濁，斷腸、空腸有5成，肝胰腺萎縮、糜爛、白膜消失，偷死約1 kg/d；感染發病給藥組，蝦的活力明顯增強，料臺拖便，空腸空胃、斷腸的蝦基本沒有，肝臟白膜變清晰、肝臟有血色，料臺上的蝦明顯增多，體色變通透，偷死只有2尾/d，吃料恢復正常。

3.2 復方中草藥KFJ制劑對蝦肝胰腺總抗氧化能力(T-AOC)的影響

圖1 T-AOC在96 h內的變化(n=6)

由圖1可知，在96 h的觀察過程中，復方中草藥KFJ制劑對蝦肝胰腺T-AOC活性有影響，投喂96 h內感染發病給藥組T-AOC活性均高于感染發病對照組和正常組；感染發病給藥組T-AOC水平在12 h達到最大值，而48 h后降低，趨于平緩、逐漸恢復正常水平；感染發病對照組T-AOC活性在3 h時為最大值，而后降低，3 h之后開始低于正常值，而正常組無明顯變化。由感染發病給藥組和感染發病對照組對比可見，感染發病給藥組與感染發病對照組肝胰腺T-AOC在96 h內的試驗對比差異具統計學意義(P<0.01)，從第6 h開始，2組出現統計學意義差異，第12 h出現最大差異，差距達9.7 U/mL。結果表明，復方中草藥KFJ制劑能抑殺肝胰腺弧菌，顯著提高蝦肝胰腺T-AOC中活性。

3.3 復方中草藥KFJ制劑對蝦肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)活性的影響

由圖2可知，復方中草藥KFJ制劑對蝦肝胰腺ACP活性有影響，在3 h之后感染發病給藥組和感染發病對照組肝胰腺的ACP活性出現統計學意義差異(P<0.05)。而感染發病給藥組ACP活性3～24 h呈上升，后趨于平緩；而感染發病對照組ACP活性在3 h達到最大值，3～12 h緩慢下降，12 h之后快速降低，且顯著低于正常水平，而正常組保持穩定。結果表明，復方中草藥KFJ制劑能提高蝦肝胰腺ACP活性。

圖2 ACP在96 h內的變化(n=6)

3.4 復方中草藥KFJ制劑對凡納濱對蝦肝胰腺堿性磷酸酶(AKP)活性的影響

兩組肝胰腺中AKP活性在96 h內的變化見圖3所示，感染發病給藥組先1～6 h呈升高，6 h后緩慢下降，后恢復正常水平；感染發病對照組AKP水平在6 h達到最大值，而后下降，而正常組維持不變。在3、6、12、24 h感染發病給藥組AKP活性與感染發病對照組之間出現極具統計學意義的差異(P<0.01)，其中6 h感染發病給藥組與感染發病對照組差值最大，為13.03 U/mL。結果表明，復方中草藥KFJ制劑能提高蝦肝胰腺AKP的活性。

圖3 AKP在96 h內的變化(n=6)

4 討 論

T-AOC、ACP、AKP的活性在蝦體免疫和抗病過程中發揮著很重要的作用，其活性的高低常被用作衡量對蝦免疫活力高低的參照指標[10]。

蝦感染弧菌發病初期，癥狀為活動減弱，攝食減少，慢料，糞便長條，體色偏暗，試驗取病蝦做弧菌培養，確診弧菌病。根據試驗數據推論，當感染發病對照組出現病癥，酶的活性在前期都有小幅的上升，但隨著病情的惡化，尤其是白膜完全消失時，檢測弧菌嚴重超標，肝胰腺壞死、萎縮、無血色，此時酶活性都急劇下降。可能蝦急性肝胰腺壞死是弧菌超標導致，而當弧菌感染蝦肝胰腺，肝胰腺白膜逐步消失，酶活性快速下降，蝦體質、免疫系統遭受破壞，蝦進入快速發病期。感染發病給藥組，在出現肝胰腺界線不分明，不通透等癥狀，及時給藥發現，酶活性慢慢恢復，蝦的活力明顯增強，肝臟白膜開始變的清晰、肝臟用藥結束三天后有血色，因此，酶活性與急性肝胰腺壞死有著緊密連續，后續養殖過程中應該更加注重強化蝦肝胰腺，提高蝦肝胰腺酶活性，從而減少病害的爆發，預防工作顯得尤為重要，KFJ制劑對保護蝦肝胰腺壞死方面有著獨特的效果，應該加大臨床應用研究。

發病對照組在弧菌侵入凡納濱對蝦后，肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而發病給藥組的酶活性逐漸上升，后恢復正常水平， 表明復方中草藥KFJ制劑不僅抑殺蝦體內弧菌，而且在保護蝦肝臟方面起到了重要作用。檢測T-AOC、ACP、AKP活性，發現感染發病對照組在弧菌侵入凡納濱對蝦肝胰腺后，造成肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而感染發病給藥組的酶活性逐漸上升，后恢復正常組水平，反應復方中草藥KFJ制劑在對蝦清除肝胰腺弧菌方面起到了重要作用。研究結果顯示，正常組酶活性存在小范圍的波動可能與吃藥量有關。

發病對照組初期酶活性緩慢下降，到48 h后快速下降，可能與取樣時蝦的病情嚴重程度有關，因此，取樣必須保證取吃料的蝦，取樣盡可能一致，減少不必要誤差。但發病對照組病情總體是越來越嚴重，肝胰腺急性壞死，難于保持取樣一致。

弧菌病是影響對蝦養殖業最為常見、危害較嚴重的一類疾病，隨著養殖業集約化程度的提高，養殖過程中的疾病也日趨嚴重，而弧菌病具有很強的傳染性，在對蝦越冬、人工育苗及成蝦養殖過程中，均有可能患上弧菌病，感染率可達100%，發病嚴重的蝦池病死率可高達90%以上[11]。

近年來弧菌病引起越來越多學者的廣泛關注，目前，對于弧菌病的防治主要采用抗生素，長期大量使用抗生素會帶來一系列嚴重后果：水環境污染，導致養殖環境惡化，生態平衡失調，妨礙水產動物正常生長；耐藥性微生物大量出現等，易引起疾病的爆發和流行，且難于防控，使水產業蒙受巨大的經濟損失[11]；弧菌病尚無有效防控措施。該試驗所用的復方中草藥KFJ制劑，對弧菌病的防治效果顯著，有望成為“替代抗生素”比抗生素更好的新型中成藥，并對人類自身的健康以及畜牧業食品的安全具有重大的社會效益和經濟價值。