HA/HI試驗在家禽免疫監測中應用的實驗教學探討

張濟培　陳濟鐺　陳建紅　司興奎

摘要：本文就紅細胞凝集（HA）與紅細胞凝集抑制（HI）試驗（微量法）在家禽新城疫等疫病免疫監測中應用的實驗課教學的若干方面，包括課程題目、教學目的、教學內容、實驗用材、操作關鍵、結果判斷、誤差規避、指導接種、時間安排等，談談自己多年來教改的探討、體會，以期達到改善本實驗課程教學效果，提高教學效率，貼近生產實際，加強生產指導作用等目的。

關鍵詞：雞新城疫;免疫監測;實驗課;教改

中圖分類號：G642.0???? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1674-9324（2019）13-0278-03

我國嚴重危害家禽健康且病原具有血凝性的病毒性傳染病，在上世紀80年代初期之前，主要是雞新城疫[1];80年代中期至90年代初期增加了鴿瘟（又稱鴿新城疫，鴿I型副粘病毒病）、產蛋下降綜合征、H9亞型禽流感等[2，3]，90年代中期之后，再增加了H5亞型禽流感、H7亞型禽流感等和水禽新城疫（也有稱水禽副粘病毒病，鵝副粘病毒病，鴨副粘病毒病）。防控上述疫病的關鍵方法之一是，實施特異免疫接種和免疫監控。而監控免疫效果的有效方法是HA（紅細胞凝集）與HI（紅細胞凝集抑制）試驗。HA與HI技術對于正確指導禽群的雞新城疫、鴿瘟、禽流感、產蛋下降綜合征等重要疫病的常規免疫接種、加強接種和緊急接種具有重要的作用。筆者經常進行本技術的實驗課教學，并不斷在解決教學難點、疑點，改善教學效果、提高教學效率、貼近生產實際、加強生產指導作用等方面進行思考，積累了一些心得，謹陳述如下，以供參考。

一、關于本實驗課的題目

病原具有血凝性的家禽病毒性傳染病，除雞新城疫，尚有鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產蛋下降綜合征等。上述各種傳染病均可應用HI試驗（微量法）進行免疫監測，實驗術式大同小異。2004年以前，本校在進行雞新城疫免疫監測實驗課教學過程中，穿插提及鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產蛋下降綜合征等的免疫監測要點。2005年以后，本校禽病學實驗教學大綱將“雞新城疫免疫監測”課題名稱改為“禽具血凝性病毒病的免疫監測——以新城疫免疫監測為例”，同時在實驗指導書中的必要環節，提示各種疫病免疫監測技術的不同要點，以期提高本實驗課的信息容量。實驗課題作了上述修改后，在實驗課開始時，要著意解題，講明何謂免疫監測，具有血凝性的病毒病主要包括哪些，本試驗以何種病的免疫監測為例等，以引起學生的注意。

二、關于本實驗課目的要求

本實驗課的目的與要求，通常只著重于“掌握雞新城疫免疫監測的方法—紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗”，這樣對于學生在獸醫專業基礎課上已學過的“紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗”知識，未能給以明顯的提升、發展。實踐證明，僅掌握紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗，尚遠遠不能滿足雞新城疫等疫病免疫監測的目的。對于即將進入禽病防治一線工作的學生，還應能依據免疫監測的結果分析禽群目前的免疫狀況，指導相應禽群實施進一步的免疫接種。故在本實驗課的具體指導過程中和實驗指導書內容中，都應注意讓學生將“依據血凝性病毒病免疫監測的結果指導禽群相應病毒病的免疫接種”作為本實驗課的重要目的之一。

三、關于實驗原理

充分了解實驗原理，對于掌控實驗整體，把握實驗關鍵，較高質量地完成實驗內容具有重要的作用。以往，筆者考慮到獸醫專業學生前期曾在微生物學課程學習過HA/HI反應原理，故在上本實驗課時，僅僅簡單地帶領學生重溫一下：“血凝性病毒具有凝集紅細胞的能力，且該能力可以被特異抗體所抑制”。后來發現，大多數學生對于該概念理解并不深刻，較難據此洞悉本實驗的原理，不利于提高學生在實驗操作過程的主動性，導致實驗教學效果大打折扣。鑒此，在近幾年的教學中，筆者設計并采用了如下的一個講授方法。

1.提問學生：“血凝性病毒具有一個重要的生物學特性是什么？”引導學生回憶：“①該類病毒具有血凝特性;②該血凝性可被相應抗體所抑制”。

2.具體解釋：上述“①”的含義和反應現象是：“如果在反應孔中依次加入血凝性病毒（抗原）和家禽紅細胞，孔底將會出現凝集圖像，讀作‘凝集，記作‘+，此反應稱為凝集反應（HA）”;上述“②”的含義和反應現象是“反應孔中加入血凝性病毒（抗原）、相應血清（抗體）、家禽紅細胞，孔底將會出現凝集抑制圖像，讀作‘凝集抑制，記作‘-，此反應稱為凝集抑制反應（HI）”。

3.推進判斷：將被檢血清作凝集抑制試驗，可以據反應結果圖像確定其中是否含有相應的抗體（孔底圖像為“凝集”時，被檢血清不含抗體;孔底圖像為“凝集抑制”時，被檢血清含有相應抗體）。

4.拓展認識：在上述HI試驗中，如果對被檢血清不作稀釋，則試驗只可獲得一個定性的結果（確定血清中有或無相應抗體）;如果對被檢血清作一系列的倍比稀釋，對每一個稀釋度的血清作HI反應，則試驗就可依據最終出現完全抑制反應的血清稀釋度的高低情況，獲得一個定量的結果（確定血清中相應抗體有多少個log2）。

經過上述方法對試驗原理作講解，絕大部分學生可以非常清楚的了解具血凝性病毒病免疫監測技術的實驗依據、基本過程及反應結果判定、記錄的基本方法等，明顯提高了學生學習本技術的主動性和學習效率。

鑒于實驗課程不允許花費過多的時間講授，筆者對上述講授內容制作了簡明的PPT，使講授可控制在5分鐘之內完成。如將本內容前置于禽病學理論課中相關疫病（如新城疫）的診斷內容中，加以扼要陳述，實驗課中再復習一下，效果會更好。

四、關于實驗用材

教師在實驗示范開始時，扼要、有序地介紹關鍵用材，有助于幫助學生對較復雜的實驗程序強化印象。在本實驗中，以新城疫免疫監測為例，介紹試驗用材時，一方面，要讓學生注意新城疫免疫監測所需的具體用材有哪些;另一方面，要讓學生注意不同的疫病，需采用哪些不同的用材。在介紹抗原時，要強調抗原必須為具有4個凝集單位的抗原。抗原凝集單位過高過低都會明顯影響抗體的檢測結果。對于準確配制4個凝集單位的抗原的術式，應強調的關鍵包括：精確地實施HA試驗操作;準確地判讀HA試驗結果;依據HA試驗結果，準確計算和量取抗原原液及稀釋液將抗原原液稀釋為4個凝集單位的抗原液;正確地對初配的4個凝集單位的抗原液作滴定檢測和必要的矯正。對于紅細胞懸浮液的配制，操作程序不算復雜，一般無大問題，要強調的是，離心洗滌紅細胞的時間、速度標準化，吸取紅細胞沉淀物溶積要準確，水禽的免疫監測試驗（即對白鴨、番鴨、鵝的血清檢測）應采用同種的成年動物的紅細胞（或為減少制備紅細胞種類，檢測水禽血清時一般可通用成年番鴨的紅細胞）配制1%的紅細胞懸浮液。還要指出被檢血清的采集時機、方法和比例。

五、關于HI試驗操作

這是本實驗課的實操重點。教師應當做一個精確到位的示范，并設法讓學生高度集中注意力觀察示范。HI實操環節常出現的問題：一是學生總感覺此操作較復雜，二是學生總會出現加樣出錯情況。據此，教師示范前先將HI試驗程序歸納為七步驟：（1）分裝稀釋液;（2）加入被檢血清;（3）稀釋血清;（4）加入4單位抗原;（5）加入紅細胞;（6）靜置感作;（7）判斷結果。示范過程，對每一個步驟邊示范邊強調1—2個關鍵點（學生易出錯點）。如分裝稀釋液注意最后一孔與前面各孔容量不同;被檢血清只加入第一孔;稀釋血清要統一吹打次數和移液準確性，最后二孔留作對照孔;最后一孔不加抗原，等等;示范結束時，讓學生共同回顧一次“七步驟”，旋即開始實操。這樣，基本上能保證95%以上的學生正確完成操作。HI試驗結果的判斷，也是完成本實驗的重中之重。如果不注意指導方法，也會使較大比例的學生出現誤判錯判的情況。依據多年的教學經驗，筆者總結了結果判斷的示教要點如下：（1）首先要學生掌握好反應結果判斷的基本時間，即以抗原對照孔和PBS對照孔反應的情況做標準，當PBS對照孔的紅細胞完全沉降到孔中央，且反應孔中的液體清亮時，為最佳反應時間，即為判定反應的終點時間。（2）以PBS對照孔的紅細胞的流淌程度為依據，凡是與PBS對照孔的紅細胞流淌情況一致的抗體檢測孔均判定為完全抑制孔。（3）要求學生逐一記錄抗體檢測孔的反應圖像。（4）根據抗體檢測孔反應系列圖像，找出完全抑制的最高血清稀釋度孔，以該孔血清稀釋度作為該血清的HI效價，寫出HI效價。（5）教師逐個檢查學生的試驗結果，特別是讓學生指出HI反應的終點孔，并讀出HI效價。

六、關于實驗誤差規避

應用HI試驗進行具血凝性病毒病的免疫監測，導致誤差的因素較多，在示教、示范過程和學生操作過程中，教師要做到心中有數，重點強調規避。除上述提及的一些操作要點外，尚需特別注意的環節有：正確使用移液器，滴管與移液器緊密接合，每次移液量盡可能準確;作抗體的稀釋吹打過程，力度要平穩，每孔樣品吹打稀釋次數一致;4單位凝集抗原配制，必須進行滴定試驗，完全凝集孔要出現在第二孔，等等。

七、關于指導雞群接種

當學生正確掌握了HI試驗方法，并取得檢測結果后，教學的重點要轉入到如何依據HI試驗結果指導被檢禽群免疫工作上。（1）要正確引導學生討論雞群抗體臨界滴度的概念，確定科學的臨界滴度;（2）讓學生理解雞群抗體合格率的計算公式和計算方法;（3）讓學生理解和掌握不同日齡雞群免疫合格的標準;

（4）指導學生以免疫檢測的結果和免疫合格標準為主要依據，同時結合雞群其他情況，如相關免疫的時間間隔、雞群健康狀況、疫病流行動態等，對雞群的進一步免疫接種提出合理的意見。

八、時間與程序安排

本實驗課內容較多，時間較緊，要比較合理地安排課程內容，穿插安排示教、示范、學生操作，討論等程序。本實驗課一般可安排2—3個課時。安排2學時時，4單位凝集抗原和紅細胞懸浮液均應預先配備。教學過程可安排為：（1）教師簡單解題和指出目的內容，確切說明原理;（2）扼要示范，點明用材，強調實驗程序和操作注意事項;（3）在教師的巡視下，學生操作至抗原抗體感作步驟;（4）利用抗原抗體感作時間，教師具體指導結果判定的記錄方法和禽群免疫指導的方法;（5）學生判定記錄結果;教師對學生實驗結果及判斷記錄逐一作確認;（6）師生共同依據免疫監測結果討論指導禽群免疫接種的方法;（7）實驗課小結，指出實驗存在問題，布置實驗報告作業，強調實驗報告寫作的注意事項。為了簡明扼要，節約時間，對于實驗原理、4單位凝集抗原制備、紅細胞懸浮液配備、實驗結果的判定方法、禽群免疫合格率計算與免疫指導方法討論等環節，都建議制備和使用合適的PPT輔助示教。

九、關于作業批改要點

就課堂教學而言，做好作業批改，是糾正學生技術錯誤，提高實驗課效率的最后一個重要環節。多年來，我們發現學生發生率較高的錯誤點，包括：不如實陳述實驗用材，誤將HA程序誤為HI程序，HI反應終點“圖”、“數”不一致（HI效價概念不清），雞群抗體臨界滴度概念錯誤，雞群抗體合格率公式套用數據錯誤，實驗報告格式欠規范，等等，這些問題都被我們列為作業批改的主要關注點。

十、小結

“雞新城疫免疫監測”實驗課非常重要。適當修改課題和課程目的，內容上兼顧到幾種相關傳染病的免疫監測;注意實驗用材、實驗操作關鍵點和結果判斷方法要點的教學指導、示范;注意講清部分容易出現歧義的概念，規避歧義;避免易造成實驗誤差的各種因素;加強應用實驗結果指導臨床免疫方法的討論、分析;精心穿插、安排教學過程中的各部分內容，提高教學效率。如此，將可進一步改善本實驗課的教學質量，使之在雞新城疫、鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產蛋下降綜合征感染等傳染病的免疫防控中發揮更多作用。不僅如此，由于本實驗涉及眾多獸醫傳統實驗的基本技能，實際上是一個獸醫實驗綜合技能訓練的實驗課程，因此，不斷探索改進本課程的教學方法，對于強化獸醫專業高年級學生獸醫實驗技能的綜合應用能力，以及提高其學習應用現代獸醫高新實驗技術的能力，均有裨益，值得同行給以更多的注意和重視。

參考文獻：

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[3]廖秀云，陶虹，邵建宏，羅寶正，薄清如，劉國昌，徐海聶，沙才華.新型基因芯片檢測禽流感病毒、新城疫病毒和雞減蛋綜合征病毒[J].動物醫學進展，2013，34（10）：15-20.

Study on the Application of HA/HI Test in Poultry Immunosurveillance

ZHANG Ji-pei，CHEN Ji-dang，CHEN Jian-hong，SI Xing-kui

（Department of Animal Medicine，College of Life Sciences and Engineering，Foshan Institute of Science and Technology，Foshan，Guangdong 528231，China）

Abstract：This paper deals with several aspects of experimental teaching in the application of hemagglutination （HA） and hemagglutination inhibition （HI） test （micro method） to the immune monitoring of epidemic diseases such as newcastle disease in poultry，including course title，teaching purpose，teaching content，and so on.Experiment material，operation key，result judgment，error evading，instruction inoculation，time arrangement，etc.，this paper discusses the discussion and experience of teaching reform in the past years，in order to improve the teaching effect and improve teaching efficiency of this experiment course.Close to the reality of production，strengthen the role of production guidance and other purposes.

Key words：newcastle disease;immune surveillance;experimental class;teaching reform