桔梗中三萜總皂苷含量測定及其抗氧化活性研究

李彥靈,陳小敏,吳振靜,康亞楠,吳凱凱,閆福林

(新鄉醫學院三全學院,河南 新鄉453003)

桔梗為桔梗科多年生植物桔梗Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根[1],首見于《神農本草經》,又名苦桔梗。桔梗廣泛生長于中國、朝鮮半島、日本和西伯利亞東部,是我國藥食同源的植物之一,在我國東北和華北地區廣泛種植。桔梗性平,味苦、辛,歸肺經,具有化痰止咳、宣暢肺氣、祛痰排膿、降血糖之功效,可用于治療外感、咳嗽、咽喉腫痛、肺癰吐痰胸悶腹脹、血淤水腫等癥,是一種很好的保健食品[2]。研究表明,桔梗富含皂苷、多糖、黃酮、酚酸、甾醇、聚炔、揮發油等成分[3]。本文主要研究桔梗中三萜總皂苷的含量及其抗氧化能力,三萜皂苷具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降低膽固醇等作用[4-5]。本文以熊果酸為對照品,采用紫外分光光度法測定總三萜含量；利用Vc作為對照品研究桔梗提取物對DPPH自由基的清除率。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

桔梗于2017年8月采自河南省輝縣萬仙山景區,經新鄉醫學院三全學院蘇慧慧老師鑒定為桔?？平酃?。熊果酸購自中國食品藥品檢定研究院,批號：110742-201622；Vc、DPPH、高氯酸、為優極純；香草醛冰乙酸、甲醇、無水乙醇均為分析純。

1.2 實驗儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；FA2004電子F分析天平,上海良平儀器儀表有限公司；HH恒溫水浴鍋,金壇市中大儀器廠；旋轉蒸發儀(R206),上海申生科技有限公司；SHZ-3循環水式多用真空泵,CCA-420低溫冷卻水循環泵,鄭州杜普儀器廠。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的配制

取桔梗藥材粉碎,過4號篩,備用。精密稱取桔梗粉末2.0g,共5份。60%的乙醇100 m L回流提取3次,每次1.0 h,過濾,合并三次濾液,減壓回收溶劑至干,甲醇溶解,定容至25 m L容量瓶中,備用。

2.2 標準溶液的配制

精密稱取熊果酸對照品適量,置于25 m L容量瓶中,甲醇溶解,定容至刻度,即得濃度為0.079 2 mg/m L的對照品溶液。

2.3 標準曲線的繪制

分別精密量取“2.2”項下制備的標準溶液0.0、0.6、0.8、0.9、1.4 m L置試管中,100℃水浴蒸干甲醇,分別加入0.2m L香草醛-冰乙酸、1.0 m L高氯酸,在60℃水浴加熱20 min后,放置于冰水浴中5 min后加入5.0 m L冰乙酸,搖勻,放置10min,在545nm處測定吸收值,結果見圖1。以濃度X為橫坐標,吸光度Y為縱坐標進行線性回歸,得標準曲線方程：Y=0.039X-0.003,r=0.999 9。

圖1 標準曲線

2.4 方法學考查

2.4.1 重復性試驗 精密稱取同一樣品2.0g,按“2.1”項下制備樣品溶液,精密吸取供試品溶液1.0 m L,按"2.3"項下自“置試管中”開始操作,在545 nm處測定吸收值,RSD為4.74%。結果見表1。

表1 桔梗三萜總皂苷含量測定重復性試驗結果

2.4.2 穩定性試驗 精密稱取同一樣品2.0 g,按“2.1”項下制備樣品溶液,精密吸取供試品溶液1.0 m L,按“2.3”項下自“置試管中”開始操作,分別在0、30、60、90、120 min測定其吸光度值,RSD為5.04%。結果見表2。

表2 桔梗三萜總皂苷含量測定穩定性性試驗結果

2.4.3 加樣回收率試驗 取同批次桔梗藥材1.0 g,共6份,精密稱定,分別精密加入對照品溶液1.0 m L,按“2.1”項下制備樣品溶液,精密吸取供試品溶液1.0 m L,按“2.3”項下自“置試管中”開始操作,測定各樣品的吸光度值,RSD值為3.07%。結果見表3。

2.5 總三萜含量測定

精密吸取供試品溶液1.0 m L,按 “2.3”項下“置試管中”開始,在545 nm測定其吸光度,運用回歸方程計算樣品中三萜總皂苷含量。結果見表4。

表3 桔梗三萜總皂苷含量測定加樣回收率試驗結果

表4 桔?？傇碥蘸繙y定結果

2.6 抗氧化能力測定

2.6.1 溶液的配制 根據參考文獻[6]的方法,精密稱取13mg的DPPH,無水乙醇溶解定容至50m L容量瓶中,取2 m L在波長517 nm處測定吸光度(A0)。

2.6.2 Vc標準曲線制備 精密稱取Vc對照品適量,無水乙醇溶解,依次稀釋成0.39、1.17、2.34、3.12、4.68、6.24、7.8、10.92、14.04、18.72、23.4、31.2μg/m L的溶液,按順序依次各吸取2.0 m L溶液置于2支試管中,各加入2.0 m L

DPPH、2.0 m L無水乙醇溶液,室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光度A1、A2。

2.6.3 樣品抗氧化能力測定 根據 “2.1”項下方法將桔梗藥材配制成78μg/m L的樣品液,依次吸取1、3、6、8、12、16、20、28、36、48、60、80 m L至100 m L容量瓶中,無水乙醇定容至刻度,按“2.6.2”項下“按順序依次各吸取2.0 m L溶液”開始測定,計算樣品的抗氧化能力。結果見圖2。

圖2 抗氧化能力結果

3 討論

DPPH指的是1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH),可用于體外評價和篩選物質抗氧化活性,該方法有穩定性好、靈敏度高、操作簡單等優點[7-8]。DPPH的乙醇溶液顯紫色,在517nm波長處有特征吸收峰,當在其乙醇溶液中加入自由基清除劑時,其孤電子被配對,溶液顏色變淺,使其在517nm波長處的吸光度變小,其吸光度的變化用于評價天然產物對自由基的清除能力,通常用清除率表示,清除率越大,表明該物質清除DPPH的能力越強[9]。

王曉林等[10]研究桔梗莖總黃酮的抗氧化效果,當桔梗莖提取物總黃酮含量在0.6mg/m L時對DPPH自由基清除率為84.60%,該結果與同濃度的Vc溶液相差不大,表明桔梗莖提取物總黃酮具有一定的體外抗氧化活性。樸向民等[11]對桔梗不同部位的體外抗氧化活性進行了研究,發現桔梗葉體外抗氧化能力最強,有望作為天然抗氧化劑原料加以開發利用。而桔梗的花、莖與根皮也表現了相對較高的抗氧化活性。而另一項報道[12]對不同產地桔梗進行抗氧化研究發現桔梗多糖對DPPH和OH自由基均有清除作用,且產于安徽的桔梗作用最強；桔梗醇提物對自由基的清除作用均強于水提物和桔梗多糖的抗氧化作用。

本文采用DPPH法對桔梗藥材進行了體外抗氧化活性研究,發現桔梗藥材有一定的清除DPPH自由基的能力,樣品濃度在31.2μg/m L時,清除率達到91.9%,接近Vc清除自由基的能力。結果表明,桔梗具有較強的自由基清除能力,說明桔梗藥材具有一定的體外抗氧化活性。上述試驗結果可為桔梗的開發利用提供基礎依據。