響應曲面法優選夏天無配方顆粒提取工藝

常云鳳,李軍山,孫福仁,霍保軍,馬 浩,姜國志

(1.神威藥業集團有限公司,河北 石家莊051430；

2.河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心,河北 石家莊050090)

本研究以夏天無藥材為研究對象,參考《中國藥典》2015年版關于夏天無的含量測定方法,以原阿片堿、鹽酸巴馬汀為指標[1],以出膏率和原阿片堿、鹽酸巴馬汀含量轉移率之和為評價指標,采用Box-Behnken響應面法優選夏天無配方顆粒的提取工藝參數,為夏天無配方顆粒的生產提供工藝指導。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相HPLC色譜儀(日本島津公司)；AE-240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)；KH-3200E超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

鹽酸巴馬汀參照物、原阿片堿參照物(購于中國食品藥品檢定研究院,批號為：110732-201510、110853-201404；純度分別為87.4%、99.7%)；乙腈為HPLC級,水為純化水,其他試劑均為分析純。本研究所用夏天無藥材經原河北省藥品檢驗研究院孫寶惠老師鑒定為罌粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.)Pers.的干燥塊莖。

2 方法

2.1 總生物堿含量測定方法[1]

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相為乙腈-三乙胺醋酸溶液(18∶82)(量取三乙胺8 m L、冰醋酸30 m L混合均勻,加水稀釋至1 000 m L)；流速為1 m L·min-1；柱溫30℃；檢測波長：原阿片堿為289 nm,鹽酸巴馬汀為345 nm。

2.1.2 參照物溶液制備

精密稱取原阿片堿對照品2 mg,置50 m L容量瓶中,加1%鹽酸溶液5 m L使溶解,再加甲醇至刻度,搖勻,即得。另精密稱取鹽酸巴馬汀對照品2 mg,置100 m L容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取本品粉末0.1 g,置錐形瓶中,精密加入25 m L 80%甲醇,稱重,超聲處理30 min(250 W,40 k Hz),放冷,稱重,用80%甲醇補足失重,搖勻,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得。

2.1.4 測定法 參照物溶液與供試品溶液進樣量各10 μL。參照物及供試品色譜見圖1、圖2。

2.2 夏天無配方顆粒提取工藝優化

以不同粉碎程度、加水量、煎煮時間、煎煮次數為考察因素及水平,以出膏率及總生物堿含量轉移率為評價指標,進行綜合評分,權重系數分別為0.4、0.6,以此對夏天無配方顆粒提取工藝參數進行優化。對各實驗組提取液進行濃縮、干燥,得干浸膏,粉碎過80目篩網,混勻,經過制粒、整粒得夏天無配方顆粒。

圖1 參照物色譜

圖2 供試品色譜

2.2.1 單因素試驗 粉碎：取夏天無藥材5份,每份100g,分別按不處理、粉碎過6、8、10、15 mm 篩,分別加入飲片量10倍的水,加熱提取60min一次。

加水量：取夏天無藥材5份,每份100 g,粉碎過8 mm篩,分別加入飲片量6、8、10、12、14倍的水提取,提取60min一次。

煎煮次數：取夏天無藥材4份,每份100 g,粉碎過8 mm篩,加入飲片量10倍的水,加熱提取30 min,分別加熱提取1次、2次、3次、4次。

煎煮時間：取夏天無藥材5份,每份100g,粉碎過8 mm篩,各加入飲片量10倍的水,加熱提取,煎煮時間分別為20、30、60、90、120 min。

2.2.2 響應曲面試驗 在單因素實驗考察結果的基礎上,篩選出需要優化的因素、水平值,導入到Box-Behnken響應曲面軟件作為自變量,以出膏率、含量轉移率的綜合評分為響應值,應用響應曲面分析(RSA)進行多元線性回歸,得出回歸模型組,從而對夏天無配方顆粒提取工藝參數進行優化。

2.2.3 驗證試驗 按照采用Box-Behnken響應曲面軟件分析所得的最佳實驗條件進行3次試驗,分別測定出膏率及含量轉移率的綜合評分,并由此得到其綜合評分的平均值,計算與模型給出的理論值的RSD值。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

單因素試驗對夏天無配方顆粒出膏率及總生物堿含量轉移率的綜合評分影響趨勢見圖3。

圖3 單因素試驗結果

3.1.1 粉碎程度對綜合評分的影響 由圖3A可看出,當不進行粉碎處理時,綜合評分最低,隨著粉碎程度的提高,綜合評分呈現先上升后逐漸平穩的趨勢。藥材經粉碎后,粒度變小,溶出速率提高；但粉末過細,吸附作用增強,提取效率降低。綜合考慮,藥材粉碎過8 mm篩網為最佳。

3.1.2 加水量對綜合評分的影響 由圖3B可看出,綜合評分在加水量為10倍后增加變緩,進入平臺期。綜合考慮,選用加入飲片量10倍的水,為最佳加水量,這樣既能節約成本,其綜合評分也能得到很好的保障。

3.1.3 煎煮次數對綜合評分的影響 由圖3C可看出,隨著煎煮次數的增加,綜合評分呈現先上升后逐漸平穩的趨勢。綜合考慮,選擇煎煮次數2次為宜。

3.1.4 煎煮時間對綜合評分的影響 由圖3D可看出,隨著煎煮時間的增加,綜合評分一直呈現上升趨勢,在60 min之前,曲線增長較快,60 min以后,增長趨于緩慢。綜合考慮,選擇煎煮時間60 min為宜。

3.2 提取工藝的響應面法優化

3.2.1 因素選擇 根據Box-Behnken的設計原理,對夏天無配方顆粒的出膏率及總生物堿含量轉移率影響顯著的破碎程度(A)、加水量(B)、煎煮次數(C)、煎煮時間(D)4個因素及水平為分析對象,以綜合評分Y作為響應值,采用4因素3水平實驗設計。因素水平見表1。

表1 因素水平

3.2.2 響應曲面試驗 采用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計,本設計共含有29組試驗點,其中24個為分析點,5個為零點。零點為重復實驗,用于試驗誤差估算。試驗方案及結果見表2。

3.3 模型的建立及其顯著性檢驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行分析,得到夏天無配方顆粒提取工藝綜合評分與各因素變量的二次方程模型為：Y=1.3+0.13A+0.14B+0.12C+0.067D-0.21A2-0.069B2-0.11C2-0.05D2-0.093AB+0.18AC-0.0023AD-0.0075BC-0.062BD-0.055CD。

對該模型進行方差分析,得出回歸模型系數顯著性檢驗結果,見表3。

表2 響應曲面法實驗方案及結果

由表3可知,所建立模型方差分析極顯著,失擬項不顯著,說明模型擬合良好,試驗誤差較小；各因素對響應值的回歸調整R2=0.932 1,說明此模型可預測提取夏天無配方顆粒的提取結果。

顯著性分析結果顯示,一次項A、B、C、D達到極顯著水平(P＜0.01),二次項A2、B2、C2達到極顯著水平(P＜0.01),D2達到顯著水平(P＜0.05),交互項AB達到極顯著水平(P＜0.01),BD、CD均達到顯著水平(P＜0.05),可知,A(粉碎程度)、B(加水量)、C(煎煮次數)、D(煎煮時間)是對夏天無水提取的線性效應和曲面效應都具有顯著影響的因素。

3.4 響應曲面分析

曲面模型模擬出的等高線和曲面圖顯示,粉碎程度與加水量的交互作用等高線為橢圓形(見圖4),說明兩個因素的交互作用顯著,且在其他2個因素不變的條件下,達到相同綜合評分值時,隨著破碎程度的增加,加水倍數逐漸降低,達到一定程度后,加水倍數再次逐漸升高。加水倍數與煎煮時間(見圖5)、煎煮次數與煎煮時間(見圖6)的交互作用等高線為類圓形,交互作用較弱。

以上分析顯示,諸因素的影響大小為：加水量＞粉碎程度＞煎煮次數＞煎煮時間。

表3 響應曲面二次回歸方程方差分析

圖4 Y=f(A,B)的等高線和響應曲面

圖5 Y=f(B,D)的等高線和響應曲面

圖5 Y=f(C,D)的等高線和響應曲面

3.5 響應曲面優化夏天無配方顆粒提取工藝條件

采用Design-Expert 8.0.6軟件,預測的夏天無配方顆粒的最佳提取工藝為：破碎程度為過8.7 mm篩,加水量為10.14倍,煎煮次數為2.54次,煎煮時間為66.3 min,由此得出的綜合評分為1.38。結合生產設備,將參數調整為：粉碎過8 mm篩網,加水量為10倍,煎煮次數為3次,煎煮時間為60 min。并重復進行3次試驗,夏天無配方顆粒的出膏率和總生物堿含量轉移率的綜合評分分別為：1.35、1.35、1.33,平均值為1.34,RSD=0.86%。

4 討論

本研究以出膏率及總生物堿的含量轉移率為綜合評價指標,將單因素試驗與響應曲面法結合,優化了夏天無配方顆粒提取的工藝參數,并確定其最佳提取工藝參數為：夏天無藥材粉碎過8 mm篩網,加水量為10倍,提取3次,每次60 min。在此提取工藝基礎上,連續生產了3批夏天無配方顆粒,結果3批配方顆粒出膏率的RSD為0.86%,總生物堿的含量轉移率的RSD為1.02%,結果穩定可靠,可用于指導生產實踐。

由于配方顆粒的制備提取溶媒為水,將大部分水溶性成分提出來,極性小的某些成分在水中溶解度小,保留在藥渣中[10],故研究以出膏率、原阿片堿、鹽酸巴馬汀為指標,進行工藝參數優化。本研究為夏天無配方顆粒的標準化、規范化生產提供了參考依據。