納豆激酶體外溶栓作用研究

許曉雙,常 珊,戴東升

(江蘇理工學院 生物信息與醫藥工程研究所,江蘇 常州213000)

血栓性疾病是血栓形成和血栓栓塞2種病理過程所引起的疾病。血栓性疾病嚴重威脅人類的生命健康,其發病率高居各種疾病之首,是當代醫學研究的重點和熱點之一[1-2],因此溶栓藥物的開發也成為了熱門研究項目。目前溶栓藥物分為3類[3-4]：第一類是鏈激酶(SK)和尿激酶(UK),溶栓效果較好且價格便宜,但容易引起顱內出血等副作用；第二類是組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)和乙酞化纖溶酶原-鏈激酶激活劑復合物,溶栓效果比第一類更好但在體內持續時間較短,需大量用藥；第三類是受關注的天然溶栓劑,比如蚓激酶、納豆激酶等,溶栓效果好且副作用小,已成為最具潛力的溶栓藥物。

納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆菌(Bacillus natto)發酵納豆得到溶栓作用強的堿性絲氨酸蛋白酶,具有成本低、半衰期長、可口服、選擇性較高等優點。為了深入探究納豆激酶的體外溶栓作用,本實驗通過天然界篩選的菌種發酵提取的納豆激酶,研究不同濃度的納豆激酶對小鼠體外溶栓作用,從而得到溶栓效果好且不溶血的最佳濃度的納豆激酶。以期為納豆激酶深入研究溶栓作用機制奠定基礎,并為納豆激酶在臨床的安全應用提供理論依據。

1 材料與試藥

6周以上健康小鼠6只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。納豆激酶由本實驗室從市售納豆中分離并篩選獲得的納豆枯草芽孢桿菌,經廣東省微生物分析檢測中心鑒定為枯草芽孢桿菌(報告編號：粵微檢2012ZD0175),固態培養并分離純化獲得[5]。采用纖維蛋白平板法[5]檢測溶栓活性方法對多批次純化樣本進行檢測,并選取兩個樣本：NK-1,平板溶栓活性檢測為6 472 U/m L；NK-2,平板溶栓活性檢測為9 427 U/m L,進行體外溶栓實驗。尿激酶注射液購自北京金賽藥業,其余試劑均為國產試劑。

2 方法

2.1 納豆激酶樣品配制

將納豆激酶樣品NK-1、NK-2分別用生理鹽水倍比稀釋至1000、500、250、125、62.5、31.25和15.63 U/m L,尿激酶為10.000 U/m L,各取上述樣品1m L于玻璃試管中備用。空白對照為PBS。

2.2 納豆激酶體外溶栓實驗

將6只小鼠分別摘眼球取血于2 m L離心管中,室溫放置1 h使血液凝固。小鼠血凝固后取出血塊,制備血凝塊16塊,分別稱重后同時放入相應的樣品試管中。隨后將玻璃試管放入37℃恒溫水浴中并于0 min,2 h、7h、18 h觀察血塊溶解情況,并在顯微鏡下觀察溶液中血細胞狀態。反應7 h后取出各試管中未完全溶解的血凝塊,用吸水紙將水分吸干后進行稱重。

溶解率(%)=(原始重量-反應后重量)/原始重量×100%。

3 結果

3.1 0～7h不同濃度納豆激酶的體外溶栓效果

不同濃度的納豆激酶(NK-1、NK-2)對小鼠體外血凝塊的溶解時間與溶解率見表1。由表1可見：①隨著NK-1與NK-2稀釋倍數的增加,其對血凝塊的溶解時間逐漸增加,溶解率逐漸下降,但均快于尿激酶組和空白對照組；②NK-1-1000、NK-2-1000、NK-2-500在7h內能完全溶解血凝塊；③250、500、1 000 U/m L的NK-1與NK-2對血凝塊的溶解作用依次增強,且NK-2比NK-1的溶解時間短。

不同濃度納豆激酶(NK-1、NK-2)對小鼠體外血凝塊的溶解率趨勢見圖1。由圖1可見：①隨著NK-1、NK-2的稀釋倍數增加,其對血凝塊的溶解率逐漸減小；②15.63、31.25、62.5 U/m L的NK-1、NK-2對血凝塊的溶解率相差不大,62.5～125 U/m L之間NK-2溶解率高于NK-1,125～250 U/m L之間NK-1高于NK-2,且125～250 U/m L之間NK-1與NK-2溶解率上升最快；③500～1 000 U/m L

NK-1與NK-2溶解率相差不大,基本完全溶解。

表1 不同濃度的納豆激酶對小鼠體外血凝塊的溶解效果

圖1 不同濃度的納豆激酶對小鼠體外血凝塊的溶解率趨勢

3.2 2～18 h不同濃度納豆激酶的體外溶栓效果

不同濃度的納豆激酶(NK-1、NK-2)在2 h和18 h時對小鼠體外血凝塊的溶解效果見圖2。由圖2可見：①反應2h時,各試管中均可見未溶解凝血塊,但NK組整體比尿激酶組與空白對照組的未溶解凝血塊小；②反應18 h時,250、500、1

000 U/m L的NK-1與NK-2均完全溶解血凝塊,其他組仍可見未溶解血凝塊；③500、1 000 U/m L的NK-1與NK-2和尿激酶組的試管顏色呈紅褐色,其他試管顏色還是較澄清,證明高濃度的NK和尿激酶可能對血紅細胞有一定的破壞作用,其他組則破壞作用較小,說明250 U/m L以下的NK溶血現象不明顯。

圖3為125、250、500、1 000 U/m L的NK-1與NK-2在反應18h時在顯微鏡下觀察的紅細胞狀態。由圖3可見,與對照組UK-1000相比,不同濃度的NK-1與NK-2均有完整的血細胞可見,因此NK對血細胞破壞力較小,同時也佐證了250 U/m L以下的NK溶血現象不明顯。

4 討論

圖2 不同濃度的納豆激酶對小鼠體外血凝塊的溶解效果(A：2h,B：18h)

圖3 反應18h時不同濃度的納豆激酶處理的血凝塊血細胞狀態

納豆激酶是食品微生物來源的纖溶酶,是具有安全性好、成本低、口服有效等優點的新一代理想的預防和治療栓塞的新型藥物[6-7]。本實驗通過天然界篩選的菌種發酵提取納豆激酶樣品NK-1與NK-2來研究不同濃度的納豆激酶對小鼠體外溶栓的效果,結果顯示2個NK-1與NK-2的實驗平行性良好,500及1 000 U/m L納豆激酶在7h內能完全溶解0.12 g左右的小鼠體外血凝塊,125、250、500、1 000 U/m L的納豆激酶溶解血凝塊作用依次增強,其中125～250 U/m L納豆激酶體外溶栓效果較好且溶血作用不明顯,500～1 000 U/m L的納豆激酶可能存在溶血作用,這可為納豆激酶新型藥物的開發提供理論依據。Sumi等[8]通過人體實驗表明口服200g納豆或2粒納豆激酶腸溶膠囊(650 mg/粒)可以明顯迅速降解纖維蛋白,從而增加血漿的纖溶活性；Cesarone等[9]評價高危受試者在長途航空旅行中口服溶栓劑150mg Pinokinase(一種含有納豆激酶和利尿劑的混合物),可明顯降低深靜脈血栓和肢體水腫的發生；Suzuki等[10]證明每只大鼠口服含約50～100 U NK的納豆提取物可以通過血栓溶解活性,抑制血管壁血栓形成而減少內膜增厚。以上研究說明NK在動物及人體實驗中均被證實具有溶栓作用,但并沒有明確具體濃度的NK用量能夠起到更好的溶栓作用。因此,本文得到的125～250 U/m L NK體外溶栓效果較好,且溶血作用不明顯的結果將為NK以后的動物及臨床研究提供實驗基礎,并且為臨床安全用藥提供一定的理論依據。