補陽還五湯對創傷性腦損傷小鼠皮質運動區神經元保護作用

潘榮斌,朱大誠,陳宏偉,歐陽厚淦,趙志冬

(江西中醫藥大學 基礎醫學院,江西 南昌330004)

目前,在世界范圍內,由車禍造成的創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)是兒童和年輕人死亡或終身殘疾的主要原因之一。而原發性腦損傷后,腦皮質神經元在一系列分子和神經化學方面的繼發性變化才是影響臨床病人死亡率的主要因素[1-2]。當前臨床治療TBI的有效化學藥物十分有限[3]。中藥復方補陽還五湯具有補氣、活血、通絡之功效,其補氣類主藥黃芪對腦神經元損傷的多個環節具有較為明顯的干預作用。本研究選取補陽還五湯為模型藥物,應用于TBI模型小鼠后,對小鼠運動行為和神經元凋亡的影響為綜合評價指標,考察其在小鼠TBI模型中通過神經元保護作用降低繼發性腦損傷危害的有效性,并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級十月齡KM小鼠144只,體重21～26g(江西中醫藥大學實驗動物中心提供,動物質量合格證號：JZDW№：2015-0160)

1.2 藥物及配制

補陽還五湯依照清代王清任《醫林改錯》原方配制。稱取黃芪120 g、當歸尾6g、赤芍4.5 g、桃仁3g、紅花3g、川芎3g、地龍3g,加入500m L雙蒸水,用砂鍋煎煮0.5h,倒出藥液,然后加入250 m L的雙蒸水煎煮15 min后倒出,取第一次煎煮的藥液導入混合,藥液再用旋轉蒸發儀旋蒸濃縮至含生藥2 g·m L-1,冷藏備用。

1.3 試劑

水合氯醛(武漢博萊特化工有限公司),多聚甲醛(江西東風藥業股份有限公司),Bax兔抗、Bcl-2兔抗(美國Affinity公司),Caspase-3兔抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

電子腦皮質挫傷撞擊儀(美國弗吉尼亞聯邦大學),電子天平(DT10K),石蠟切片機(RM2135型)(德國Leica公司),顯微照相儀(BX-41)(日本OLYMPUS),自動雙重蒸餾器(上海亞榮生化儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥

將實驗小鼠隨機分為模型組、假手術組和用藥組。然后每組按給藥時間分為1、3、7、14天四個亞組,除去手術或意外等原因死亡的小鼠后,每個亞組各留6只小鼠以備實驗。用藥組為補陽還五湯灌胃給藥,給藥劑量按照db=da×(Rb/Ra)×(Wa/Wb)1/3的公式換算(da、db是a、b兩種動物每kg體重所需的劑量；Ra、Rb是兩種動物的體型系數,小鼠和人的分別是59和100；Wa、Wb分別代表人和小鼠的體重)。除第一次灌胃在造模后4 h,其余每日固定時間灌胃1次。模型組和假手術組則給予同等體積的生理鹽水。

2.2 實驗動物造模

模型組及用藥組造模：麻醉小鼠,將頭部固定,手術區域消毒后用手術刀正中切開皮膚約1.5 cm,除去顱骨表面的骨膜,用微型磨鉆在左側離前囟前2mm,前囟后1mm,矢狀縫旁3.5mm,鉆3mm×3mm的顱窗,暴露硬腦膜。將小鼠移至eCCI操作臺上,參照文獻[4-5]建立中度TBI模型,將撞擊參數設定為：速度6 m·s-1,停留時間：200 ms,深度2 mm。撞擊后,向損傷部位滴注4萬單位青霉素2～3滴預防感染,取小塊骨蠟封閉缺損骨窗,細線縫合皮膚,對皮。各組動物均完成造模后,放回籠中,單獨喂養。假手術組造模除手術暴露硬腦膜后,不破壞硬腦膜完整性、不進行打擊之外,其余操作與模型組和給藥組相同。

2.3 小鼠運動行為學評價：平衡木行走實驗

將一條長0.8 m、寬2.5 cm的木條懸空放置于距地面10 cm高度,將小鼠放置于平衡木中間,用攝影機記錄其2 min的活動情況,依據文獻[6]菲尼計分標準計分：各組小鼠分別在第1、3、7、14天測量運動功能變化,重復操作3次取平均值。

2.4 尼氏染色觀察小鼠皮質運動區病理形態學變化

對實驗小鼠動物稱重,麻醉,沖洗灌注,開顱取腦,4℃固定24 h。以腦損傷區為中心分別切取矢狀面3 mm厚腦組織,梯度乙醇脫水,常規石蠟包埋,連續做5μm厚腦組織冠狀切片。尼氏染色,進行神經元細胞的觀察。

2.5 免疫組化染色及圖片定量分析

對腦組織切片進行免疫組織化學染色(滴加的相對應一抗為Bax,1∶200；Bcl-2,1∶100；Caspase-3,1∶100,三種試劑均為兔抗多克隆抗體),后置于光鏡下(10×40)采集TBI周邊區圖片；采用ImageProPlus6.0圖像分析軟件得到相應的AOD值,進行隨機3個視野的AOD之和的平均數作為計數值。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 運動行為學評價結果—平衡木行走實驗

模型組小鼠在TBI后1、3天表現較差,大都不能順利穿過平衡木或直接跌落。7、14天組情況有所改善,部分能穿過平衡木,但跌倒概率大于50%。模型組與假手術組比較,差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)；而用藥各組小鼠隨著給藥時間增加,運動表現改善愈加明顯,其3、7、14天表現均優于模型組,7、14天組差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01)。見表1。

3.2 組織病理切片—尼氏染色觀察結果(圖1)

模型組小鼠TBI周邊區神經細胞排列稀疏,變性較嚴重,胞漿內尼氏體減少,染色變淺,隨著時間推移,正常形態細胞數量有下降趨勢；與模型組比較,用藥組相應區域正常形態神經元增多,尼氏體較豐富,染色深。

表1 行為學實驗結果 (±s,n=6)

表1 行為學實驗結果 (±s,n=6)

注:與假手術組比較,*表示P＜0.05,**表示P＜0.01；與模型組比較,◆表示P＜0.05,◆◆表示P＜0.01

組別 平衡木得分假手術組 0.60±0.04模型1天組 4.35±0.06**模型3天組 3.15±0.04**模型7天組 2.55±0.07**模型14天組 2.25±0.05**用藥1天組 3.90±0.09**用藥3天組 2.55±0.07*用藥7天組 1.85±0.06**◆◆用藥14天組 1.45±0.07*◆◆

圖1 各組小鼠腦損傷周邊區切片尼氏染色照片400X

3.3 免疫組化定量分析結果

3.3.1 Bax蛋白表達分析結果 模型各組之間相比較,TBI周邊區Bax蛋白的表達,1、3天組均大于7、14天組；模型各組與假手術組相比較,TBI周邊區Bax蛋白表達明顯增強,各組統計結果差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；用藥各組與模型組相比較,用藥組1、3天與模型組同時相比較,Bax蛋白的表達略有下降,但差異沒有統計學意義。用藥組7、14天組與模型組7、14天相比較,其TBI周邊區的Bax蛋白的表達顯著減弱,AOD值統計結果差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。見表2、圖2。

3.3.2 Bcl-2蛋白表達分析結果 模型組各時間段相比較,TBI周邊區Bcl-2蛋白表達隨時間的增加呈遞減的趨勢,1天組和14天組之間的差異據有統計學意義(P＜0.05),而1天組和3、7天組相比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。模型組3、7、14天組之間雖然呈遞減的趨勢,但是差異無統計學意義(P＞0.05)；模型組與假手術組相比較,模型組TBI周邊區Bcl-2蛋白表達有顯著區別,其差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；用藥各組小鼠與模型組相比較,用藥3、7、14天組TBI周邊區的Bcl-2蛋白表達顯著增強,統計結果具有顯著統計學意義(P＜0.01)。見表2、圖3。

表2 免疫組化各組小鼠腦損傷周邊區Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測的結果 (±s,n=6)

表2 免疫組化各組小鼠腦損傷周邊區Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測的結果 (±s,n=6)

注:與假手術組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,◆P＜0.05,◆◆P＜0.01。

組別 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Caspase-3假手術組 0.14±0.01 0.23±0.07 0.63 0.20±0.06模型1天組 0.68±0.02**0.44±0.04**1.54 0.44±0.05**模型3天組 0.72±0.07**0.41±0.03**1.76 0.52±0.06**模型7天組 0.56±0.05**0.38±0.08**1.47 0.41±0.08**模型14天組0.50±0.06**0.36±0.06**1.39 0.38±0.05**用藥1天組 0.59±0.04**0.55±0.05◆**1.07 0.37±0.06**用藥3天組 0.52±0.06**0.33±0.07◆◆**1.06 0.46±0.04*用藥7天組 0.31±0.04◆**0.29±0.05◆**1.07 0.25±0.02◆◆**用藥14天組0.27±0.05◆**0.28±0.05◆◆**0.96 0.23±0.01◆◆**

圖2 各組小鼠腦損傷周邊區切片Bax免疫組化染色照片400X

圖3 各組小鼠腦損傷周邊區切片Bcl-2免疫組化染色照片400X

3.3.3 Caspase-3蛋白表達分析結果 模型組與假手術組相比較,模型組TBI周邊區Caspase-3蛋白表達明顯增強,差異有顯著統計學意義(P＜0.01),用藥各組與模型組相比較,用藥7、14天組TBI周邊區的Caspase-3蛋白表達顯著減弱,差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。補陽還五湯1天組、3天組與之相比較雖有減弱,但差異沒有統計學意義。見表2、圖4。

圖4 各組小鼠腦損傷周邊區切片Caspase-3免疫組化染色照片400X

4 討論

目前,已有很多來自動物和人體的研究證據,TBI可誘導損傷周邊區的神經元凋亡進而促進繼發性腦損傷(secondarybraininjury,SBI)的發生[7],神經元的凋亡對TBI后神經細胞數量減少和功能減退具有重要影響。本實驗對TBI后各組小鼠進行行為學評價,結果顯示補陽還五湯在一定程度上促進TBI后運動功能恢復,這種改善隨著用藥時間成正相關,表明其對皮質運動區神經元有一定的保護作用。通過尼氏染色法檢測TBI周邊區的正常神經元數量,補陽還五湯組在用藥早期與模型組無明顯差別,但隨用藥時間延長,補陽還五湯組的正常形態神經元明顯增多,變性凋亡細胞減少,表明補陽還五湯可在一定程度上抑制TBI后的細胞凋亡,減少神經元細胞的損傷。國內有研究顯示,補陽還五湯可通過上調與細胞凋亡有關的Bcl-2蛋白的表達,降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達以及Bax/Bcl-2的比值而發揮神經保護作用[8-9],本實驗免疫組化結果顯示,相比模型組,補陽還五湯組小鼠TBI周邊區的Bcl-2蛋白表達明顯增高,而Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達及Bax/Bcl-2的比值則較為明顯降低,表明補陽還五湯可能通過上述機制抑制TBI后的神經細胞凋亡,從而保護損傷區神經元,改善神經功能。

綜上所述,本實驗證實補陽還五湯有促進TBI后小鼠運動行為的改善,對TBI損傷周邊區神經細胞有較為明顯的保護作用,其可能機制之一為通過上調Bcl-2蛋白的表達,降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達以及Bax/Bcl-2的比值,從而抑制損傷周邊區的神經元凋亡。