雷公藤甲素對內毒血癥大鼠血管低反應性的影響

宗佳琪，王爍陽，蘇 萍，郭馬娣，刁光華，王 靜，周萍萍，王海華

(1.皖南醫學院生理教研室，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫學院臨床醫學院，安徽 蕪湖 241002)

內毒血癥是革蘭氏陰性菌侵入血液，并在其中大量繁殖、崩解后釋放出大量炎癥因子所致，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分。LPS可以刺激體內巨噬細胞、中性粒細胞和內皮細胞，產生一系列的炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)。這些炎癥因子促使全身血管對縮血管物質和舒血管物質的反應降低，即血管低反應性，若不積極進行治療，將發展成持續低血壓、致死性感染性休克、全身器官衰竭，最終導致死亡[1-2]。臨床上，通常采用抗生素和糖皮質激素作為治療內毒血癥的常規手段，但治療效果不佳[3-4]。因此，本研究旨在為治療內毒血癥導致的血管低反應性提供新的干預策略。雷公藤甲素(triptolide，TP)具有各種藥理活性，如抗炎、免疫抑制、抗菌作用，是從中藥雷公藤中提取出來的二萜類成分[5]。研究證實，TP通過減輕LPS刺激的Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等蛋白的表達，從而減輕小鼠急性肺損傷[6]。TP能改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病心肌病大鼠心臟的收縮功能和心肌能量代謝[7]。然而，TP是否能夠調節LPS內毒血癥大鼠模型的胸主動脈血管張力仍不清楚。因此，通過復制內毒血癥大鼠模型觀察TP對其血液流變性及血管張力的作用，從而為內毒血癥的臨床治療提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 主要試劑 TP(T819207，純度≥98%)：上海麥克林生化科技有限公司；LPS[L82749(026:B6)]、氯化乙酰膽堿(acetylcholine，ACh；純度≥99%)、去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe；純度≥98%)、左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME；純度≥99%)、亞甲藍(methylene blue，MB；純度≥99%)：美國Sigma公司；K-H液(NaCl 118.4 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO324.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.1 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.55 mmol/L，C6H12O6·H2O 11.1 mmol/L)：國產分析純。

1.2 主要儀器 體外組織灌流裝置(PL3508B5/C-V)和Power Lab系統：澳大利亞埃德儀器公司。

2 方法

2.1 內毒血癥大鼠模型復制 60只SD雄性大鼠，體質量為(220±20)g，SPF級，購自安徽省合肥市蜀山實驗動物繁殖中心[動物生產許可證號為SCXK(魯)2014-0007]，室溫24 ℃下適應性喂養7 d。用LPS 10 mg/kg腹腔注射復制內毒血癥大鼠模型。內毒血癥模型復制成功的標準：注射LPS 6 h后，動物沒有死亡，并表現出盤縮成團、萎靡不振、腹瀉、活動力低下，伴有發紺、震顫以及血壓明顯下降。

2.2 實驗動物分組及處理 將大鼠隨機分為6組(n=6)：正常組(NC組)、內毒血癥模型組(LPS組)、TP低濃度干預組(LPS+TP-L組)、TP中濃度干預組(LPS+TP-M組)、TP高濃度干預組(LPS+TP-H組)和多黏菌素B組(LPS+PMX-B組)。

TP用0.1% DMSO溶解，TP低劑量(25 μg/kg)、中劑量(50 μg/kg)、高劑量(100 μg/kg)干預組在復制內毒血癥模型組前15 min進行腹腔注射，LPS+PMX-B組(0.2 mg/kg)以尾靜脈注射。所有大鼠均隨機直接復制模型和給藥后進行相應的實驗。所有動物實驗均經學校倫理委員會批準進行。

2.3 大鼠平均動脈壓(mean arterial blood pressure，MABP)和血流動力學指標測定 采用25%烏拉坦4 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠并固定，從大鼠右頸總動脈插管監測MABP，繼而將插管插入心室，測量大鼠血流動力學指標：心率(heart rate，HR)、左室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)、左心室內壓最大上升/下降速率(maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure，±dp/dtmax)，待以上指標穩定后，記錄30 min數據并進行統計學分析。

2.4 胸主動脈環的制備 大鼠采血后，開胸迅速取出其胸腹段主動脈，置入4 ℃預冷的K-H液(pH 7.4)中。按照文獻[8]的方法將其分成3～4 mm的血管環4段，采用棉簽輕輕摩擦以去除內皮，制備去內皮血管環。通過PL3508B5/C-V體外組織灌流裝置和Power Lab系統記錄血管環張力變化，并檢測其內皮完整性。內皮完整的血管環記為E+，去內皮的血管環記為E-。

2.5 血管環收縮和舒張功能的測定 累計加入10-8～10-5mol/L Phe刺激血管環(E+和E-)，觀察并記錄其對血管環收縮反應的影響；用10-6mol/L Phe預收縮血管環(E+)，待其收縮達到平臺期后累計加入10-8～10-4mol/L ACh，觀察并記錄其對血管環舒張反應的影響；分別用10-4mol/L的非特異性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME或10-5mol/L的鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase，GC)抑制劑MB孵育血管環(E+)20 min，再累計加入10-8～10-5mol/L Phe刺激，觀察并記錄其對E+血管環收縮反應的影響。整理數據，按以下公式計算血管收縮率和血管舒張率：血管舒張率=(Phe刺激后最大收縮張力-累加ACh后的張力)/(Phe刺激后最大收縮張力-基礎張力)×100%；血管收縮率=(累加Phe刺激后的收縮張力-基礎張力)/空白組收縮張力均值×100%。

3 結果

3.1 各組大鼠MABP比較 與NC組比較，LPS組大鼠MABP明顯降低(P<0.05)；LPS+TP-H組與PMX-B組大鼠MABP無明顯改變(P>0.05)；與LPS組比較，LPS+TP-M組、LPS+TP-H組與LPS+PMX-B組大鼠MABP均明顯升高(P<0.05)。見圖1。

注：A. NC組；B. LPS組；C. LPS+TP-L組；D. LPS+TP-M組；E. LPS+TP-H組；F. LPS+PMX-B組；與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠血流動力學比較 與NC組比較，LPS組大鼠HR、LVDP和±dp/dtmax均顯著降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+TP-L組、LPS+TP-M組、LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組大鼠HR和±dp/dtmax均顯著升高(P<0.05)，LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組大鼠LVDP均顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A. NC組；B. LPS組；C. LPS+TP-L組；D. LPS+TP-M組；E. LPS+TP-H組；F. LPS+PMX-B組；與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.3 TP對血管環張力的影響

3.3.1 TP對Phe誘導的主動脈環(E+)收縮反應的影響 與NC組比較，不同濃度Phe使LPS組主動脈環的收縮率明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，TP干預組和LPS+PMX-B組主動脈環的收縮率明顯上升并呈濃度依賴性遞增(P<0.05)。見圖3。

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.3.2 TP對Phe誘導的去內皮主動脈環(E-)收縮反應的影響 與NC組比較，在不同濃度Phe刺激下，LPS組去內皮血管環的收縮率明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，TP干預組對不同濃度Phe刺激的去內皮血管收縮率無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

3.3.3 TP對ACh誘導的主動脈環(E+)舒張反應的影響 與NC組比較，在不同濃度ACh刺激下，LPS組大鼠主動脈環的舒張率明顯降低(P<0.05)；TP干預組大鼠主動脈環舒張率呈濃度依賴性遞增，與LPS組比較，LPS+TP-M組、LPS+TP-H組和LPS+PMX-B組各濃度ACh引起的主動脈環舒張率均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

3.3.4 TP對Phe誘導的L-NAME和MB預處理主動脈環(E+)收縮反應的影響 L-NAME和MB孵育20 min后，各組主動脈環在Phe的刺激下，收縮幅度均顯著升高(P<0.05)；而經L-NAME預處理前后，LPS組主動脈環對10-5mol/L Phe引起的收縮率差值顯著高于LPS+TP-H組和NC組[LPS組(61.55%±14.54%)vsLPS+TP-H組(43.09%±9.75%)，P=0.023；LPS組(61.55%±14.54%)vsNC組(36.75%±17.98%)，P=0.018]。而經MB預處理前后，LPS組主動脈環對10-5mol/L Phe引起的收縮率差值顯著高于LPS+TP-H組和NC組[LPS組(49.59%±11.49%)vsLPS+TP-H組(32.27%±3.87%)，P=0.023；LPS組(49.59%±11.49%)vsNC組(29.74%±11.39%)，P=0.044]。見表1、表2。

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

圖5 TP對ACh誘導的主動脈環(E+)舒張反應的影響

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05；與LPS+TP-L組比較，◇P<0.05；與LPS+TP-M組比較，◆P<0.05；與LPS+TP-H組比較，□P<0.05；與LPS+PMX-B組比較，▲P<0.05；與NC+L-NAME組比較，△P<0.05；與LPS+L-NAME組比較，◎P<0.05

表2 TP對Phe誘導的MB預處理主動脈環(E+)收縮率的影響

注：與NC組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05；與LPS+TP-L組比較，◇P<0.05；與LPS+TP-M組比較，◆P<0.05；與LPS+TP-H組比較，□P<0.05；與LPS+PMX-B組比較，▲P<0.05；與NC+MB組比較，△P<0.05；與LPS+MB組比較，◎P<0.05

4 討論

內毒血癥病情兇險，臨床治療效果不佳，并且具有發病率及病死率高的特點[9]。因此，尋找一種新的治療方案相當重要。本研究采用腹腔注射LPS這一經典的實驗方法來復制內毒血癥大鼠模型，方便且成功率高。實驗結果表明，用LPS刺激大鼠6 h后，MABP、HR、LVDP、±dp/dtmax較NC組顯著下降，這與內毒血癥的病程發展相一致[10]。全身性不可逆的血壓降低是內毒血癥的主要癥狀，而血壓的調節又與血管的張力息息相關。因此，本研究采用體外胸主動脈血管環灌流來探究TP對LPS誘導的內毒血癥大鼠血管張力的影響及其可能的機制。

TP是從中藥雷公藤提取出來的有效活性成分，其來源廣泛，具有抗炎、抗生育、免疫抑制等藥理作用，但對血管的作用尚不明確[11]。本實驗結果表明，與LPS組比較，TP干預組大鼠動脈血壓和心功能等血流動力學指標均明顯改善，主動脈環對Phe的收縮率亦明顯恢復，與LPS+PMX-B組的變化趨勢相似。而去內皮血管環實驗顯示，TP干預組對Phe的收縮率與LPS組無顯著差異。與NC組比較，LPS組血管環對ACh的舒張率顯著降低，而TP干預組隨著濃度的升高主動脈血管環對ACh的舒張率明顯升高，由此推測TP對LPS誘導的內毒血癥大鼠有保護作用。后續的血管環實驗結果顯示，經NOS阻斷劑L-NAME孵育20 min后，LPS組主動脈環對10-5mol/L Phe引起的收縮率的差值高于LPS+TP-H組和NC組，提示TP可能降低LPS刺激的NOS過量產生，從而減少NO的過量產生，改善血管環的收縮率。再者，經GC抑制劑MB孵育20 min后，LPS組主動脈環對10-5mol/L Phe引起的收縮率的差值高于LPS+TP-H組和NC組， 提示TP干預組可能是通過GC-cGMP途徑，改善主動脈平滑肌的收縮率。

NO是一種舒血管的物質，它由血管內皮細胞產生。NO作為氣體很容易擴散進入平滑肌細胞，使鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase，GC)被激活，使三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)轉變為環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)。細胞內cGMP的含量增多可以激活蛋白激酶G，這是一種可以在很多部位引起蛋白質磷酸化的磷酸化酶，最終結果導致Ca2+外流、膜超極化以及降低收縮結構對Ca2+的敏感性，繼而松弛血管平滑肌，導致血管舒張[12]。主動脈血管環對Phe誘導的血管收縮的機制是通過升高血管平滑肌細胞內Ca2+水平來實現的。有研究表明，LPS刺激產生的炎癥因子可使NOS過量產生，從而導致NO的過量產生，進而降低細胞內Ca2+水平，從而導致血管的低反應性[13]。

綜上所述，本研究初步探明TP對內毒血癥大鼠的血管具有保護作用，可能是通過改善內皮功能而實現的，確切機制有待進一步探究。