毛果楊AGO基因家族生物信息學分析

張麗華 王婷 陳群 王曉立 韓浩章

摘? 要：Argonautes（AGOs）蛋白是生物有機體中普遍存在的一類比較保守的蛋白質，在不同物種的RNAi及相關的途徑中具有十分重要的功能，也調控著模式植物擬南芥的生長發育過程。該研究利用AGO蛋白的保守域在毛果楊基因組中進行同源比對，鑒定出毛果楊AGO基因家族成員13個，并對其成員進行了理化性質分析、motif結構比對、進化樹構建、基因表達分析等。結果表明：毛果楊AGO基因家族成員基因長度為2463～3189bp，編碼的蛋白質具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785 結構域。PtAGO 基因分布于第1、6、8、9、10、12、14、15、16條染色體上，存在著串聯重復序列。AGO 蛋白定位于葉綠體、細胞核和胞質中，偏堿性和親水性，具有較高的脂溶指數、不穩定性。基因組織表達分析表明，毛果楊PtAGO成員在不同組織中的表達有明顯差異，在與木材形成相關的組織、器官中有較高的表達。

關鍵詞：毛果楊;AGO蛋白;基因家族;生物信息

中圖分類號 S792.11文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）04-0012-04

Abstract：Argonautes（AGOs） proteins are a class of relatively conserved proteins ubiquitous in biological organisms，and play important roles in RNAi and related pathways of different species，and also regulate the growth and development of model plants Arabidopsis thaliana.In this study，a conserved domain of AGO protein was used to perform homologous alignment in the genome of P. simonii，and 13 members of AGO gene family of P. simonii were identified，and physical and chemical properties，motif alignment，phylogenetic tree construction，Gene expression analysis，etc.The results showed that the AGO gene family members were 2463-3189 bp in length，and the encoded proteins had conserved Piwi，PAZ and DUF1785 domains.The PtAGO gene is distributed on chromosomes 1，6，8，9，10，12，14，15，and 16 with tandem repeats.AGO protein is localized in chloroplast，nucleus and cytoplasm，alkaline and hydrophilic，with high fat solubility index and instability.The analysis of gene tissue expression showed that the expression of PtAGO members in different tissues was significantly different，and it was highly expressed in tissues and organs related to wood formation.

Key words：Populus trichocarpa;AGO protein;Gene family;Bioinformation

AGO（Argonaute）基因普遍存在于各類生物基因組中，不同生物的AGO蛋白結構相對保守，通常有PAZ和PIWI 2個特征域。在小RNA分子介導的RNA沉默途徑中，AGO蛋白是沉默復合物的主要成分[1]，AGO蛋白可以與這些小RNA介導的不同類型的小非編碼RNA結合，特異性結合小RNA互補靶的靶RNA，靶基因被AGO蛋白本身的核酸內切酶活性切割，從而導致靶基因的失活[2]。研究發現，擬南芥AGO基因家族中有10個成員，主要分為3類[3]。在多種植物中，例如擬南芥和水稻，AGO蛋白和小RNA形成調節植物生長和發育的復合物，它在應激反應和防御病毒入侵方面發揮了重要作用[4]。不同物種的AGO蛋白可以通過協同作用控制植物的生長和發育[5]。

目前，對毛果楊Populus trichocarpa AGO基因（PtAGO）功能的研究仍然滯后。本文系統研究了PtAGO蛋白家族域的序列比對，系統發育樹和AGO蛋白的理化性質，以此為進一步研究PtAGO基因家族的功能與作用提供理論依據，也為進一步研究PtAGO蛋白在RNAi等相關途徑中的分子機制奠定基礎。

1 數據來源與分析方法

1.1 數據來源 本研究以毛果楊為實驗對象，包括國家生物技術信息中心（NCBI）和毛果楊基因組數據（植物基因組數據站點植物組學）。

1.2 分析方法

1.2.1 Argonaute蛋白基因的搜索與確認 在毛果楊（Populus trichocarpa）基因組中發現每種AGO蛋白的同源序列作為候選蛋白。在獲得與候選蛋白質序列類似的AGO基因后，這些基因用作二級查詢的序列，繼續搜索并多次查找和補充以確定毛果楊中所有替代AGO家族成員。然后在PFAM和SMART蛋白結構域在線分析預測位點上分析所有候選基因的候選蛋白結構域，并且得到的基因是Populus trichocarpa的AGO基因家族的所有成員。

1.2.2 毛果楊Argonaute基因家族的基因網站查詢分析 毛果楊（Populus trichocarpa）基因家族成員結構分析：基因名稱，位置染色體，基因序列大小，編碼序列大小，外顯子和內含子數，搜索探針等。

1.2.3 毛果楊Argonaute基因家族物理化學性質和亞細胞定位 主要使用在線軟件EXPASY Protparma（expasy網站）來分析AGO基因家族成員的理化特性。使用在線軟件Plant-mPLoc預測毛果楊（Populus trichocarpa）AGO基因家族成員的亞細胞定位。

1.2.4 motif結構對比和系統發育樹建立 使用TBtools軟件對AGO基因家族成員進行基序結構分析;使用MEGA 5.0軟件為毛果楊（Populus trichocarpa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AGO基因家族成員構建系統發育樹。

1.2.5 AGO基因家族器官組織的基因表達 在Affymetrix網站上搜索AGO基因家族成員的探針，并通過BAR數據庫（bar.Utoronto）檢索成員的組織表達的相對量。運用聚類熱圖軟件 Multiple Experiment Viewer繪制AGO基因家族組織表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 毛果楊AGO基因家族的結構 經過不斷的分析驗證，最終確定了13個毛果楊AGO基因家族成員（表1）。毛果楊AGO基因的基因序列長相差較大，其中最長的為 POPTR-0001 s22710 g基因，有2.15kbp，然而最小的為 POPTR-0008 s01100 g基因。AGO基因的編碼序列差異不大，最長的是POPTR-0012 s03410 g基因，長度為3189bp。而最短的也有2463bp，是 POPTR-0010 s09150 g基因。POPTR-0010 s17100 g、 POPTR-0012 s11920 g、POPTR-0015 s15780 g的外顯子數量只有3～4個，而其他 AGO家族成員的外顯子數量超過20個，表明這些基因家族成員的不同功能和不同作用模式由結構差異顯示。

2.2 AGO基因家族成員的理化特性和亞細胞定位預測 預測并分析了毛果楊AGO蛋白的理化特性和亞細胞定位，如表2所示：毛果楊AGO蛋白的理化特性及亞細胞定位預測。分析結果顯示，毛果楊AGO基因家族13位成員的氨基酸序列數量都比較多，有820～1062個氨基酸。毛果楊AGO蛋白的等電點（PI）為8.91～9.45。毛果楊AGO蛋白的分子量在96689.19～117666.56Da，13位成員的分子量之間相差較小，相對比較平衡。毛果楊AGO蛋白的親水性為-0.33～-0.537。毛果楊AGO蛋白的不穩定指數，除了POPTR～0012 s11920g和 POPTR～0015 s15780 g蛋白穩定指數小于40，其他AGO蛋白穩定性指數均大于40，表現出不穩定性。毛果楊AGO蛋白的脂溶性指數都比較大，平均都在73.53～85.88。亞細胞定位預測（表2）：毛果楊AGO蛋白主要分布在葉綠體和細胞核中。這個數據表明，毛果楊蛋白AGO蛋白與其行使的功能的位置保持一致。

2.3 毛果楊和擬南芥AGO蛋白motif分析 對毛果楊的AGO基因家族的13個成員進行蛋白質基序分析。毛果楊AGO基因家族的氨基酸數量都比較大，并且具有類似的motif結構。

2.4 AGO蛋白系統發育樹 對毛果楊AGO基因家族的13位成員和擬南芥AGO家族的10位成員的基因編碼進行了系統發育樹的構建。毛果楊和擬南芥的23個基因家族成員，它們可以分為3個類別，每個類別具有不同的支持率。A類中有9個成員，其中毛果楊AGO基因家族5個成員，擬南芥AGO基因家族4個成員。B組有8名成員，毛果楊有5名AGO基因家族成員，擬南芥AGO基因家族有3名成員;在C類中有6個成員，在擬南芥中有3個AGO基因家族成員。由于每個類都有來自毛果楊和擬南芥的AGO基因，因而可以從中推斷出毛果楊的祖先種類含有至少3個AGO基因，這也表明AGO基因起作用在植物發育中具有重要功能的基因家族在進化上是保守的。A類中POPTR-0006s02680g和POPTR-0016s02480g，AGO8和AGO10，POPTR-0014s15760g和AGO6的基因座位;B類中POPTR-0006s12010g和POPTR-0009s00660g，POPTR-0012s03410g和AGO1，POPTR-0008s15860g和POPTR-0010s09150g的基因座分別是高度重復的，并且分別聚集在小分支上。在C類中，可以看出，C類的每1個小的分支上的基因座位都具有較高的重復性，由此可以推斷，在毛果楊物種分化后，基因重復事件就開始了。同時，所有AGO蛋白都有3個功能域，即：Piwi、PAZ、DUF1785。

2.5 毛果楊AGO基因表達 在Affy網站檢索到了11個AGO基因的探針集，而未檢測到POPTR_0010s09150g基因的相應的探針集，POPTR_0006s02680g的探針集雖然檢測到了，但是沒有相應的數據分析。獲得的AGO家族基因在根，葉，幼葉，雌花，雄花，木質部等中的轉錄表達數據。根據AGO基因在不同組織部位的表達數據制作熱圖所示：AGO基因家族的幾乎所有成員都有不同的表達差異。大多數毛果楊AGO基因在成葉，雌花上的基因表達量很少，大部分毛果楊AGO基因在幼葉上的基因表達量相對較多，遠遠高于其他組織的表達量。通過仔細觀察，可以發現POPTR_0008s01100g基因在雌花和雄花上的基因表達量遠遠高于其他組織的基因表達量，這就說明，該基因的主要作用部位位于雌花和雄花。

3 討論與結論

3.1 討論 植物AGO蛋白功能的鑒定主要在模式植物如擬南芥中進行，取決于它所結合的sRNA是否參與子葉的分化，在植物病毒感染期間發育調節花器官形成，莖尖分生組織和RNAi調節[6]。目前，AGO家族的2個最近成員AGO1和AGO10研究最多，主要涉及莖尖分生組織的維持。而且通過RNAi機制調控LFY（LEAFY）、AP1（ APETALA1）和AG（AGAMOUS）基因的表達，它最終影響植物的分生決定，開花轉化和花器官的測定，以及 KNOX，AG和AP3對葉和花粉管的分化[7]。AGO1和AGO10還可以通過分別調控miR172和miR165/166以引起成花干細胞的終止[8]。雖然AGO1是miR168的靶基因，但最近的研究表明它通過miR168的協調調節在應激反應和信號傳導中起重要作用，而且這種作用機制是保守的。表達分析表明，AGO1廣泛存在于各種組織中，而AGO10僅位于分生組織，導管和側器官原基的近軸末端。此外，水稻中有19個AGO家族基因，主要在繁殖生長階段表達，特別是在穗期。其中6個基因能夠響應激素處理，且大多數基因與DCL（Dicer-like）、DRB（Double-stranded RNA binding）參與RNA沉默的基因，例如 RDR（RNA依賴性 RNA聚合酶），在生長和非生物脅迫中共表達。番茄（Lycopersicum esculentum）中有15個SlAGO基因，其中大部分基因在番茄黃葉病毒感染和非生物脅迫中顯著增加[4]。SlAGO1蛋白和miR168在決定植物生長速率，發育階段變化，葉片上調，果實起始和擴展以及其他發育階段中起重要作用。雖然AGO蛋白家族成員在模式植物中的作用和作用機制研究取得了很大進展，但對木本植物AGO蛋白家族基因的研究卻很少。從PtAGO克隆PeAGO5a和PdAGO5b基因，編碼的氨基酸序列含有3個保守結構域DUF1785，PAZ和Piwi。差異表達分析表明，它可能參與楊樹插條不定根發育的二次生長，是木本植物的重要特征[9]。最近的研究表明，AGO1和AGO10在不同位點通過miR165/166作用于莖尖分??生組織的分化[10]，木質植物形成層的分化已經通過miR165/166確認，并且AGO蛋白家族的成員是否作用于該過程或者哪個家族成員作用于該過程，還需要進一步的研究[11]。同時，該研究的結果表明AGO4b.1在木質部高表達，但在其他組織中不表達。而AGO4可以通過RNA-directed DNA methylation（RdDM）途徑與Heterochromatic siRNAs作用調控DNA的甲基化，復合物在細胞質中組裝，然后通過細胞核運輸到細胞核以發揮其功能。AGO4是否通過調節DNA甲基化途徑調節毛果楊木材的形成和發育需要進一步研究。

3.2 結論 本研究獲得了PtAGO基因家族的結構特征，13個基因家族成員主要分布在9條染色體上。染色體1，6，8，9，10，12，14，15和16的染色體高度重復，AGO基因的基因位點較高。所有的AGO蛋白都存在3個功能結構域：Piwi、PAZ、DUF1785。同時，根據毛果楊AGO基因在不同的組織部位的表達數據分析，推測出毛果楊AGO基因家族不同成員在不同組織中的基因表達量，從而得到該基因的作用部位主要在根、幼葉和木質部上。

參考文獻

[1]Tolia N H，Joshua-Tor L .Slicer and the Argonautes[J].Nature Chemical Biology.2007，3（1）：36-43.

[2]Ghildiyal M，Zamore P D.Small silencing RNAs：an expanding universe.[J].Nature Reviews Genetics，2009，10（2）：94-108.

[3]許鑫，李丹丹，李雙江，等.玉米AGO基因的克隆與表達分析[J].西北植物學報，2014，34（3）：449-453.

[4]Mallory A，Vaucheret H.Form，function，and regulation of ARGONAUTE proteins[J].Plant Cell，2010，22（12）：3879-3889.

[5]Mallory A，Vaucheret H.Form，Function，and Regulation of ARGONAUTE Proteins[J].The Plant Cell，2010，22（12）：3879-3889.

[6]Zhu H L，Hu F Q，Wang R H，et al.Arabidopsis argonaute10 specifcally sequesters miR166/165 to regulate shoot apical meristem development[J].Cell，2011，145（2）：242-256.

[7]Kidner C A，Martienssen R A.The role of ARGONAUTE1（AGO1） in meristem formation and identity[J].Dev Biol，2005，280（2）：504-517.

[8]Ji L，Liu X，Yan J，et al.ARGONAUTE10 and ARGONAUTE1 regulate the termination of floral stem cells through two microRNAs in Arabidopsis[J].Plos Genetics，2011，7（3）：e1001358.

[9]Meng X，Wenfan X，Huixin P，et al.Cloning and Characterization of ARGONAUTE Genes in Populus[J].Scientia Silvae Sinicae，2011，47（3）：46-51.

[10]Zhu H，Hu F，Wang R，et al.Arabidopsis Argonaute10 Specifically Sequesters miR166/165 to Regulate Shoot Apical Meristem Development[J].Cell，2011，145（2）：0-256.

[11]Lijuan J，Xigang L，Jun Y，et al.ARGONAUTE10 and ARGONAUTE1 Regulate the Termination of Floral Stem Cells through Two MicroRNAs in Arabidopsis[J].PLoS Genetics，2011，7（3）：e1001358.

（責編：張宏民）