長鏈非編碼RNA在脊髓損傷中的研究進展

李子煜，程 里，祁 雷，余水生，姚 飛，張理乾，查小偉 綜述 荊玨華 審校

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常見的中樞神經系統創傷，可造成患者嚴重且持續的運動和感覺功能障礙，給個人、家庭乃至整個國家帶來沉重的經濟和社會負擔[1]。SCI的病理進程可以分為兩個階段：原發性損傷(第一階段)和繼發性損傷(第二階段)。原發性損傷主要由壓迫、挫傷或膨脹等導致的即刻機械性損傷，這一階段常無法避免或干預。繼發性損傷主要包括神經細胞凋亡、軸突脫髓鞘和切斷、小膠質細胞活化和膠質瘢痕形成等，這一階段持續時間可達數周甚至幾個月且影響較重，但可以進行干預[2]。因此，利用治療措施中斷或抑制繼發性損傷階段有望促進SCI后功能恢復。SCI的治療已經成為神經再生領域的研究熱點，但目前臨床SCI的治療效果并不理想，因此不斷探索并總結新的SCI治療方式具有重要的科學和社會意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是由長度大于200個核苷酸組成的非編碼RNA，這類RNA并無編碼蛋白質功能，但可以在生物體內多種組織廣泛表達，且具有構成染色質及基因表達調控等功能，從而參與到多種生理以及病理進程[3-4]。相關研究表明lncRNA參與到生理病理進程中從而發揮功能的機制主要包括：① lncRNA與染色質復合物相作用[5]；② lncRNA作為蛋白質和酶的調節因子[3, 6]；③ lncRNA與DNA/RNA結合蛋白相作用[7]；④ lncRNA與DNA直接相作用[8]。且相關研究表明lncRNA在SCI前后表達水平具有明顯差異，且在SCI修復過程中起著重要作用[9-10]。因此，深入探討并總結lncRNA參與SCI的功能和機制，將提高對SCI發病機制的認識，為SCI的治療策略提供新的思路。本文將與SCI修復相關的lncRNA研究進展進行綜述。

1 lncRNA在SCI后的表達與功能

在SCI前后lncRNA表達具有明顯差異。2016年丁亞 等[9]利用基因芯片技術檢測小鼠SCI后第1、3、7和21天(相當于SCI第二階段)lncRNA差異性表達譜。結果表明在SCI后第1天lncRNA未見明顯差異性表達；在第3天時，可以發現大量lncRNA出現差異性表達，其中212個lncRNA表達上調，290個lncRNA表達下調；在第7天時，差異性表達lncRNA數量較第3天明顯增加，其中326個lncRNA表達上調，565個lncRNA表達下調；在第21天時，差異性表達lncRNA數量較第3天和第7天明顯減少，其中141個lncRNA表達上調，40個lncRNA表達下調。根據京都基因與基因組百科全書(the database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)對差異性lncRNA進行分析，發現這些差異性lncRNA可能通過神經配體受體信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路、黏附斑激酶信號通路、生化代謝信號通路、破骨細胞分化因子信號通路及溶酶體信號通路等生物學通路參與到SCI后神經系統功能紊亂及神經細胞生長、凋亡等進程。此外，2017年Duran et al[11]利用RNA測序技術檢測大鼠SCI后1、2和3月時lncRNA表達情況，發現277個lncRNA出現差異性表達。經進一步分析發現這些差異性表達lncRNA可能與SCI進程中信號級聯、表觀遺傳修飾和免疫反應等功能有關。繼上述研究之后，2018年Zhou et al[10]利用基因芯片技術檢測SD大鼠SCI后2 h(相當于SCI第一階段)lncRNA差異性表達譜，P<0.05以及表達水平改變2倍以上被認為具有差異性表達。結果表明SCI后772個lncRNA差異性表達，其中528個lncRNA(68.39%)表達上調，244個lncRNA(31.61%)表達下調。此外，lncRNA表達上調最高者達124倍，lncRNA表達下調最低者達15倍。經進一步分析發現這些差異性表達lncRNA可能通過Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)信號通路、p53信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路和Janus激酶-信號轉導子和轉錄激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT)信號通路參與到SCI后損傷免疫應答、小膠質細胞神經保護反應、神經細胞凋亡及創傷相關炎癥反應等進程。

綜合以上研究表明：在SCI后lncRNA差異性表達明顯，且具有時間差異性。這些差異性表達lncRNA在SCI病程發揮著重要作用。

2 lncRNA-SCIR1、lncRNA-XIST和lncRNA-Map2k4在SCI中的作用

2.1lncRNA-SCIR1在SCI中的作用SCI后，星形膠質細胞、成纖維細胞和巨噬細胞在損傷位點共同形成致密的瘢痕，從而阻止進一步損傷[12]。然而，這種瘢痕自身的物理性屏障作用以及分泌抑制性因子將會阻止神經纖維的再生[13]。Wang et al[14]利用轉錄組測序技術檢測大鼠SCI后第1、4和7天時lncRNA及mRNA表達情況，篩選出一種在SCI后不同時間點表達水平均明顯降低的lncRNA(RGD1559747，編碼基因位于4號染色體鋅指蛋白(Zfp775)側面)并命名為lncRNA-SCIR1。此外，在體外培養的星形膠質細胞中使lncRNA-SCIR1表達沉默之后，發現星形膠質細胞明顯增殖數量達2倍以上，且遷移能力明顯增強。這初步表明lncRNA-SCIR1的下調可以通過促進星形膠質細胞增殖和遷移進而促進SCI后損傷位點瘢痕的形成。為進一步探討lncRNA-SCIR1的可能作用機制，研究者篩選出與lncRNA-SCIR1相關性最高的，且已被證實參與到SCI進程中的4個mRNA，其中腎上腺髓質素(adrenomedullin，Adm)mRNA和骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein 7，Bmp7)mRNA在SCI后表達水平明顯升高，而無翅型MMTV整合位點家族成員3(wingless-type MMTV integration site family member 3，Wnt3)mRNA和α-突觸核蛋白(alpha-synuclein，SNCA)mRNA在SCI表達水平明顯降低。相關研究[15-16]已經證實Wnt3的上調以及Bmp7的下調可以促進髓鞘再生并且緩解神經膠質抑制，從而促進SCI后功能恢復。當在體外培養的星形膠質細胞中沉默lncRNA-SCIR1表達后，發現Bmp7表達明顯升高，而Wnt3表達明顯降低。進一步說明lncRNA-SCIR1可能通過下調Bmp7以及上調Wnt3從而促進SCI后神經功能恢復。

2.2lncRNA-XIST在SCI中的作用Gu et al[17]利用基因芯片技術檢測大鼠SCI前后lncRNA表達情況，結合GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫篩選出一種表達差異性顯著的lncRNA-XIST，該lncRNA在SCI后的第1、3、7天表達均明顯增加。相關研究[18]表明lncRNA-XIST在腫瘤細胞凋亡方面具有重要作用。當SCI大鼠lncRNA-XIST表達被沉默之后，發現SCI位點凋亡細胞數量明顯減少，且大鼠運動功能BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分明顯提高，初步表明lncRNA-XIST的下調對SCI后大鼠具有保護作用，可以促進其功能恢復；此外，相關研究[19]表明lncRNA-XIST在乳癌中可以抑制PI3K/AKT信號通路，且PI3K/AKT信號通路在SCI后的細胞凋亡進程中起著重要作用[20]。當抑制SCI后大鼠體內lncRNA-XIST表達時，AKT及其下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)磷酸化水平明顯升高。進一步表明SCI后，抑制lncRNA表達可以激活PI3K/AKT信號通路；大量研究[4]表明lncRNA可以作為競爭性內源RNA(competing endogenous，ceRNA)競爭性抑制相應miRNA(microRNA)的表達從而發揮基因表達調控的作用。研究者利用生物信息學軟件篩選出一種受到lncRNA-XIST調控并與細胞凋亡有關的miRNA-494，經研究發現在SCI后lncRNA-XIST可以下調miRNA-494的表達。此外，相關研究[21]表明同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)作為PI3K/AKT信號通路負性調控蛋白，可以抑制SCI后神經再生及功能恢復。經進一步實驗研究發現，SCI后miRNA-494的過表達可以通過抑制PTEN表達，進而激活PI3K/AKT信號通路，最終抑制神經細胞凋亡且促進大鼠運動功能恢復。綜合lncRNA-XIST對miRNA-494表達的抑制作用且經過體內實驗驗證發現：下調lncRNA-XIST可以上調miRNA-494表達，從而抑制PTEN的表達進而激活PI3K/AKT信號通路，最終抑制神經細胞凋亡并促進大鼠運動功能恢復，起到治療SCI的作用。

2.3lncRNA-Map2k4在SCI中的作用Ding et al[22]利用基因芯片技術檢測小鼠SCI前后lncRNA差異性表達情況，發現一種lncRNA(ENSMUST 00000138093)在SCI后表達水平明顯下降，且其表達水平與成纖維細胞生長因子1(fibroblast growth factor 1，FGF1)mRNA表達水平呈動態相關。已有研究[23]表明FGF1是一種神經營養因子，在膠質細胞中有高水平的表達，且具有神經保護和神經再生功能。繼Ding et al[22]研究之后，Lv et al[24]將lncRNA(ENSMUST00000138093)命名為lncRNA-Map2k4，并利用生物信息學軟件篩選出與其相關性較高的miRNA-199a，經實驗研究表明在脊髓神經元細胞中lncRNA-Map2k4可以作為ceRNA抑制miRNA-199a的表達；經進一步研究表明在脊髓神經元細胞中，miRNA-199a的上調可以抑制FGF1的表達。結合lncRNA-Map2k4對miRNA-199a的調控作用，經一系列驗證實驗表明下調lncRNA-Map2k4可以通過上調miRNA-199a進而抑制FGF1的表達；進一步研究發現lncRNA-Map2k4和FGF1兩者均可以促進脊髓神經元細胞的增殖及抑制凋亡，而miRNA-199a可以抑制神經元細胞增殖并促進凋亡。因此，lncRNA-Map2k4可以通過競爭性抑制miRNA-199a表達從而促進FGF1的表達，最終促進脊髓神經元細胞的增殖及抑制凋亡，起到治療SCI的作用。

2.4其他lncRNA在SCI中的作用神經干細胞(neural stem cells，NSCs)可以增殖分化為星形膠質細胞、神經元細胞和少突膠質細胞，且大量研究[25]表明調控NSCs增殖及分化可以作為SCI的潛在治療手段。Zheng et al[26]研究發現lncRNA-UCA1在NSCs中的表達呈時間依賴性上調，當敲除該lncRNA基因后NSCs增殖受到抑制。經過進一步研究發現，敲除lncRNA-UCA1基因可以促進miRNA-1表達進而抑制轉錄因子Hes1的表達，從而抑制神經球的形成，同時抑制NSCs向星形膠質細胞增殖分化并促進NSCs向神經元分化。因此，lncRNA-UCA1對NSCs增殖及分化的調控作用有望作為SCI后神經修復的潛在治療手段。

氫化硫被公認為中樞神經系統中一種重要的神經調節劑和神經保護劑，并且硫化氫對SCI后的脊髓缺血再灌注損傷具有保護作用[27]。Liu et al[28]研究發現大鼠脊髓缺血再灌注損傷后，硫化氫的干預可以促進lncRNA-CasC7的表達并降低miRNA-30c的表達，同時硫化氫可以抑制缺血再灌注損傷導致的神經細胞凋亡。經進一步研究發現：硫化氫可以上調lncRNA-CasC7的表達從而競爭性抑制miRNA-30c的表達，進而抑制神經細胞凋亡，最終對脊髓缺血再灌注損傷大鼠模型起到保護作用。因此，lncRNA-CasC7可以作為SCI治療的潛在靶點。

小膠質細胞(microglial cells，MGs)作為中樞神經系統中的一種吞噬細胞，在神經細胞的營養、保護和修復中發揮著重要的作用[29]。Zhou et al[30]研究發現，SCI后大鼠脊髓中lncRNA-MALAT1表達水平明顯升高，并伴有IKKβ/NF-κB(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase/ nuclear factor kappa-B)信號通路的激活以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白介素-1β(interleukin 1 beta,IL-1β)水平升高。經進一步研究發現MGs中lncRNA-MALAT1可以通過競爭性抑制miRNA-199b的表達從而激活IKKβ/NF-κB信號通路并促進TNF-α和IL-1β的表達。此外，敲除lncRNA-MALAT1基因可以促進SCI后大鼠運動功能恢復。因此，敲除lncRNA-MALAT1可以通過調控miRNA-199b/IKKβ/NF-κB信號通路從而抑制SCI后MGs炎癥反應，起到治療SCI的作用。

3 展望

目前治療SCI的研究主要是針對繼發性損傷階段，其病理過程主要包括神經細胞凋亡、軸突脫髓鞘和切斷、小膠質細胞活化和膠質瘢痕形成等。但由于SCI繼發性損傷的病理進程非常復雜且具體機制仍未明確，導致臨床上仍未有理想的治療措施。因此，探索新的SCI治療手段并研究其機制具有重要的科學和社會價值。近年來，大量研究表明lncRNA可以通過調控基因表達等作用在多種疾病進程中發揮著重要作用。本文中討論的各種研究表明lncRNA在SCI的病理進程中同樣發揮著重要作用，并且調控相應lncRNA表達水平可以抑制繼發性損傷并促進SCI后功能恢復，這對于設計新的分子治療方案具有重要意義(圖1)。因此，未來更多基于lncRNA與SCI的研究有望為SCI的臨床治療提供新的方案。

圖1 長鏈非編碼RNA在脊髓損傷中的作用簡圖