吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤篩選及其機(jī)制研究

陳 冉，王寶石，劉明明，劉新華，石靜波

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤發(fā)生率的40%～50%，并且有著高復(fù)發(fā)率、高致死率和低治愈率的特點(diǎn)[1]。盡管采用放射治療聯(lián)合替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的存活率5年內(nèi)仍然低于5%[2]。化學(xué)療法作為腫瘤三大治療方案之一，近年來在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中受到的關(guān)注越來越多[3]。化療藥物結(jié)構(gòu)多樣，很多藥物都是以雜環(huán)骨架為結(jié)構(gòu)母核設(shè)計(jì)合成得到的。其中，氮取代的稠雜環(huán)化合物在抗腫瘤治療中有極大的研究價(jià)值[4]，如FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的氮取代稠雜環(huán)類抗腫瘤藥物艾樂替尼、帕比司他、甲磺酸樂伐替尼等[5]。吡唑并[4,3-d]嘧啶是常見的氮取代稠雜環(huán)化合物之一，其作為潛在的抗腫瘤化療藥物受到了藥物化學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[6]。 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生[7]，研究[8]證明，抑制PI3K/Akt/mTOR通路是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在方案。因此，該研究對(duì)合成得到的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，選取神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞，研究化合物9的體外抗腫瘤作用，初步探討其作用機(jī)制，為吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞和人胃癌MGC-803細(xì)胞均由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.1.2主要試劑 化合物1～10由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化教研室合成提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；胰酶購自上海生工生物工程股份有限公司；噻唑藍(lán)購自北京奇華盛生物技術(shù)有限公司；兔抗Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR購自美國Abcam公司；抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC購自美國貝博公司。

1.1.3主要儀器 Multiskan MK3酶標(biāo)儀購自荷蘭Thermo forma儀器有限公司；NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SHELLAB公司；Sigma3-16K高速離心機(jī)購自美國Sigma公司；Bio-Rad powerpac 164-5070電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳2～3代后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以4 000個(gè)/100 μl/孔，接種于96孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后至細(xì)胞單層鋪滿孔底面積的2/3。從孔邊緣小心吸棄培養(yǎng)基，各加入一定濃度梯度的化合物，100 μl /孔，每組設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。避光條件下，加入MTT溶液20 μl /孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO，150 μl /孔，置搖床上低速振蕩15 min。在酶標(biāo)儀492 nm處測量各孔的吸光度值(optical density,OD)，以對(duì)照孔調(diào)零。記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率，抑制率(inhibitory concentration，IC)(%)=[(1-(實(shí)驗(yàn)組OD均值-空白組OD均值)/(對(duì)照組OD均值-空白組OD均值)]×100 %，實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，并計(jì)算均值和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的U87-MG細(xì)胞，分別予以相應(yīng)濃度的化合物9(2、4、8 μmol/L)處理24 h，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌并收集所有細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，離心棄去上清液，加入400 μl的Annexin V Buffer工作液重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin-V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液同條件下孵育10 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4Western blot檢測 將U87-MG細(xì)胞接種于六孔板中(0.25×106/ml)，2 ml/孔，待細(xì)胞貼壁后，加入上述三種濃度的化合物9，處理24 h。收集細(xì)胞，并用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，按照1 ml裂解液加入10 μl PMSF的配方，加入適量裂解液，搖勻置于冰上裂解30 min，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中蛋白含量，并稀釋配平。蛋白樣品采用10%～12%的SDS-PAGE電泳，200 mA恒流條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，置于搖床上緩慢震蕩，TBST洗膜3次后，4 ℃孵育一抗(按照1 ∶1 000比例稀釋)過夜，TRIs-HCL-Tween TBST洗膜3次后，室溫孵育二抗(按照1 ∶10 000比例稀釋)1 h，TBST洗膜3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法觀察蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)MTT法檢測10個(gè)化合物對(duì)四株腫瘤細(xì)胞株(人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人胃癌MGC-803細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞)的增殖抑制情況，化合物處理時(shí)間為48 h，阿霉素(ADM)做陽性對(duì)照藥，見圖1。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0分析，得到具有較好抗腫瘤活性(IC50≤60 μmol/L)的化合物，見表1。結(jié)果顯示，化合物4、5、8和9對(duì)四株腫瘤細(xì)胞株均有明顯增殖抑制作用，其中，化合物9抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，IC50僅為(2.22±0.67) μmol/L，小于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞陽性藥TMZ的IC50。表明化合物9可能是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在先導(dǎo)物。因此，就該化合物9的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制開展了初步的研究。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的

-：表示 半數(shù)抑制率IC50>60 μmol/L；NT：表示不具有檢測意義

2.2化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示：化合物9處理U87-MG細(xì)胞24 h后，濃度在2、4、8 μmol/L時(shí)，增殖已經(jīng)有顯著抑制(t=3.283，P<0.01)，IC50為(4.37±1.13) μmol/L；處理U87-MG細(xì)胞48 h后，細(xì)胞抑制率升高(t=2.945，P<0.01)，IC50為(2.22±0.67)μmol/L；處理U87-MG細(xì)胞72 h后，細(xì)胞增殖普遍被抑制(t=3.174，P<0.01)。見圖2。表明化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴性。因此，本實(shí)驗(yàn)選定2、4、8 μmol/L 3個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度，給藥時(shí)間為24 h。

2.3化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用不同濃度(2、4、8 μmol/L)的化合物9處理U87-MG細(xì)胞24 h后，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡率。檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞凋亡率隨著化合物9濃度升高而增加，呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)化合物9濃度達(dá)到8 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組的相比顯著增加。見圖3。提取各組總蛋白，用Western blot檢測技術(shù)檢測U87-MG細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增大，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量減少，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)。見圖4。

2.4化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響U87-MG細(xì)胞分別經(jīng)2、4、8 μmol/L 3個(gè)濃度處理24 h后，采用Western blot技術(shù)檢測信號(hào)通路蛋白(p-mTOR、 mTOR、p-Akt和Akt)的表達(dá)情況。p-mTOR蛋白和p-Akt蛋白的表達(dá)量都隨著化合物9濃度增加而減少，與此同時(shí)，mTOR蛋白和Akt蛋白的表達(dá)量沒有受到化合物9濃度改變的影響，基本保持不變。見圖5。提示化合物9可能通過抑制PI3K/ Akt/ mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖的影響

3 討論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由大腦膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的、最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[9]，為了克服這一難題，近年來國內(nèi)外相繼展開了大量關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤化療藥物的研究。化療藥物結(jié)構(gòu)類型多，基于基本結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，是尋找新型化療藥物的常用手段。文獻(xiàn)研究表明許多藥物是基于吡唑并嘧啶母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或者修飾產(chǎn)生的，例如別嘌呤醇[10]、扎來普隆、茚地普隆[11]等。吡唑并嘧啶有多個(gè)同分異構(gòu)體，包括吡唑并[1,5-a]嘧啶、吡唑并[5,1-b]嘧啶、吡唑并[4,3-d]嘧啶和吡唑并[3,4-d]嘧啶等，均具有重要且廣泛的藥理學(xué)研究價(jià)值。其中，吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物被證實(shí)具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，可作為抗腫瘤藥物骨架被修飾。因此，大量的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物被合成出來，以評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性并研究其作用機(jī)制，然而其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤上的抗腫瘤研究卻很少被報(bào)道。本研究選取4種腫瘤細(xì)胞株(人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，人胃癌SGC-7901細(xì)胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞和人胃癌MGC-803細(xì)胞)，對(duì)合成的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，結(jié)果表明，化合物9在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞上的抗腫瘤活性最強(qiáng)，有望作為抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的先導(dǎo)物展開進(jìn)一步研究。因此，該研究以神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察化合物9對(duì)該細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明，化合物9顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)其凋亡。

圖3 化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡率的影響

圖4 化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)會(huì)被激素、生長因子和其他刺激因子激活，活化的PI3K激酶會(huì)生成第二信使即三磷脂酰肌醇(3-phosphoinositide, PIP3)，三磷脂酰肌醇作用于下游的信號(hào)分子Akt，導(dǎo)致AKt構(gòu)象改變，同時(shí)磷酸化Akt蛋白上的Ser124/Thr450和Thr308/Ser473兩個(gè)位點(diǎn)，繼而使Akt激活，活化的Akt進(jìn)一步激活下游信號(hào)分子mTOR，激活的mTOR通過調(diào)控兩個(gè)下游分子核糖體S6蛋白激酶(S6K)和真核生物啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。據(jù)報(bào)道[12]，活化的PI3K/ Akt/ mTOR信號(hào)通路會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性從而削弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤化療藥物TMZ的治療效果。因此，抑制PI3K/ Akt/ mTOR信號(hào)通路是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤極有潛力的研究方向[13]。本研究顯示，化合物9處理24 h后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞中，在Akt和mTOR總蛋白的表達(dá)量基本無變化的前提下，它們的下游通路蛋白p-Akt和p-mTOR的蛋白含量都減少。化合物9可能是通過抑制PI3K/ Akt/ mTOR通路促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡。

圖5 化合物9對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響

綜上所述，化合物9可作為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在新型先導(dǎo)物。該研究為吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。