氧化應激在鎘抑制小鼠睪丸間質細胞睪酮合成中的作用

朱文祥，劉必勇，劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗，徐德祥

近年來，鎘的雄性生殖毒性問題受到越來越多的重視，其生殖毒性作用的主要靶器官是睪丸。鎘能引起成年雄性大鼠或小鼠發生明顯的睪丸損傷、精子數量和活力降低甚至不育[1-3]。睪酮是一種對雄性生殖系統生長和發育都極為重要的雄性激素[4]。睪酮合成障礙是引起睪丸損傷以及降低精子質量的一個主要因素。本課題組前期研究[5-6]顯示，鎘暴露會抑制TM3細胞睪酮的合成，其抑制作用可能與鎘下調TM3細胞睪酮合成路徑中關鍵酶基因和蛋白的表達有關。但目前對鎘通過何種機制下調睪酮合成酶的表達進而抑制睪酮合成尚未清楚。

鎘誘導的雄性生殖毒性與氧化應激密切相關[7]。本課題采用TM3細胞作為研究對象，觀察鎘處理對其睪酮的分泌影響以及氧化應激指標的變化，探討氧化應激在鎘引起的TM3細胞損傷中的作用，為闡明氧化應激影響男性生殖損傷的機制和指導男性生殖健康提供參考依據。

1 材料與方法

1.1細胞培養TM3細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，加入2.5%胎牛血清(經滅活)、5%馬血清(經滅活)和1%雙抗溶液的DMEM/F12培養基，并且在37 ℃、5% CO2的培養箱中貼壁培養。

1.2化學試劑睪酮含量檢測ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜購于美國Millipore公司；RT和PCR試劑盒購于美國Promega公司；化學物發光增強檢測試劑盒購于美國Pierce公司；β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于北京博奧森科技有限公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；其他未說明生化試劑均購于美國Sigma公司。

1.3細胞處理待培養瓶中的細胞在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養長至瓶底80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化，充分混勻后制成約106/ml的細胞懸液。接種一定數目的細胞于培養皿和培養瓶中，分別于特定處理時間后收集細胞上清液和細胞用于睪酮的含量和氧化應激相關指標的檢測。

1.4ELISA法檢測睪酮含量TM3細胞經20 μmol/L CdCl2處理4 h、8 h后，1 000 r/min離心10 min后收集上清液，用ELISA法檢測睪酮的含量。按照ELISA 試劑盒說明書檢測步驟操作后，15 min內用酶標儀在波長450 nm處重復測量3次各孔的OD值，并取平均值按照曲線方程計算各孔細胞上清液中睪酮的含量。

1.5Westernblot法檢測血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和血紅素加氧酶-2(hemeoxygenase-2,HO-2)蛋白的表達鎘處理(4 h、8 h)后收集細胞，刮下貼壁細胞后用RIPA裂解液在冰盒上用攪拌器攪拌裂解5 min，冰上靜置裂解20 min左右，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，吸取上清液(盡量不要吸到底部的沉淀)于1.5 ml的離心管，置于冰上。采用BCA試劑盒測定裂解液中總蛋白濃度，將蛋白樣品用RIPA裂解液稀釋定量至同一濃度。細胞蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4 ∶1的比例混合后，在蛋白變性儀上100 ℃、10 min進行蛋白變性。加熱變性后的細胞總蛋白樣品置于-20 ℃或-80 ℃冰箱中儲存待用。樣品經SDS-PAGE電泳、轉膜后，采用5% 脫脂牛奶封閉后的PVDF膜分別用一抗[β-actin(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶6 000)及HO-2(1 ∶1 000)] 4 ℃孵育過夜，之后用抗小鼠或抗兔IgG[β-actin(1 ∶40 000)、HO-1(1 ∶50 000及HO-2(1 ∶40 000)]于搖床上室溫孵育2 h左右。用含0.05% Tween-20的DPBS洗滌3次(10 min/次)，最后再用DPBS洗滌1次(5 min)，之后用Tanon顯影儀器(化學發光)檢測相關蛋白的表達水平。Western blot結果分析：用內參β-actin將目的蛋白的表達水平標化，將對照組標化后的比值定為1。

1.6RT-PCR法檢測氧化應激相關mRNA的表達用20 μmol/L鎘處理TM3細胞4 h、8 h后收集細胞提取RNA后吸取一定體積的RNA樣品。隨后用AMV法對細胞樣品RNA進行逆轉錄。使用氧化應激相關mRNA[SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px、過氧化氫酶(catalase,CAT)]的引物與樣品RNA進行擴增反應。使用LightCycler 480 PCR儀，擴增條件為：95 ℃預變性10 min，然后按95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s的程序進行45次循環反應。以18S作為內參，使用LightCycler 480 PCR儀統計分析軟件對所有的實時定量數據進行相對定量分析。見表1。

表1 基因引物序列

1.7統計學處理采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA) 進行組間差異的檢驗，兩組間比較用Q檢驗(Students-Newman-Keuls，SNK) ，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CdCl2處理對TM3細胞睪酮分泌的影響實驗結果顯示：CdCl2處理TM3細胞4 h和8 h后上清液中的睪酮含量明顯低于對照組，差異均有統計學意義(F=140.8,P<0.01)。見圖1。

圖1 CdCl2對TM3細胞睪酮分泌的影響與對照組比較：**P<0.01

2.2CdCl2處理對TM3細胞抗氧化酶體系mRNA表達的影響結果顯示，CdCl2處理組SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px和CAT mRNA的表達水平均呈下降的趨勢，其中CdCl2處理8 h組SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px及CAT mRNA的表達水平與對照組比較均下降，差異均有統計學意義(F=12.58、18.89、55.24、91.66、30.32，P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。見圖2。

2.3CdCl2處理對TM3細胞HO-1mRNA和HO-1、HO-2蛋白表達的影響與對照組相比，CdCl2處理TM3細胞4 h 后HO-1 mRNA的表達量顯著上升(F=545.20,P<0.01)， TM3細胞HO-1 mRNA的表達在CdCl2處理8 h組中進一步增高(圖3A) (F=545.20,P<0.01)；HO-1蛋白在CdCl2處理的TM3細胞中被顯著誘導表達，并且隨著CdCl2處理時間的增加，這種誘導的作用更加明顯(圖3B) (F=588.70,P<0.01)；TM3細胞中HO-2蛋白的表達量與其被CdCl2染毒前后無明顯相關(圖3C)。

3 討論

睪丸間質細胞是睪丸中的內分泌細胞，其主要功能是合成和分泌睪酮。睪酮對男性正常生殖功能的維系尤為重要。動物體內研究[6]結果表明，鎘能夠損害睪丸發育，減少精子發生，其可能與鎘抑制睪酮的合成和分泌有關。本課題組采用TM3細胞的體外研究表明，鎘處理組TM3細胞的睪酮含量明顯低于對照組，提示其能抑制TM3細胞中睪酮的分泌和合成。

圖2 CdCl2處理后TM3細胞抗氧化相關酶mRNA的表達A：SOD1；B：SOD2；C：SOD3；D：GSH-Px；E：CAT；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 CdCl2處理后對TM3細胞HO-1和HO-2表達的影響A：HO-1 mRNA；B：HO-1；C：HO-2；與對照組比較：**P<0.01；與4 h組比較：##P<0.01

許多研究已表明，氧化應激在鎘引起的雄性生殖毒性中發揮重要作用。SOD在機體暴露于氧化應激時可被迅速誘導，能催化超氧化物自由基歧化(或分配)成分子氧和過氧化氫。CAT是絕大部分需氧生物體中的常見酶，可以將過氧化氫分解成分子氧和水，保護細胞免受氧化損傷[8]。在大量研究中，當生物體遭受環境化學物質誘導的氧化應激時，SOD和CAT的活性及其基因的轉錄會發生改變[9]。除SOD和CAT以外，谷胱甘肽(GSH)是動物中最重要的硫醇化合物，可以保護細胞避免其受氧化損傷[10]。本研究顯示，鎘處理組的TM3細胞SOD1、 SOD2、 SOD3、 GSH-Px和 CAT mRNA表達降低。提示鎘抑制TM3細胞抗氧化酶的表達，使其發生氧化應激并造成損傷，并可能損害其睪酮合成的功能。

HO-1由HMOX1編碼，是一種能將血紅素降解成一氧化碳(CO)，亞鐵離子(Fe2+)和膽綠素并具有抗凋亡和抗炎的細胞保護性酶，參與各種病理生理過程[11]。許多研究提出，HO系統的活性能提供細胞保護來抵抗氧化應激。HO-1為誘導型酶，正常情況下體內表達很低，但在應激或炎癥發生等情況下， HO-1被誘導表達以維持機體的內環境穩態[12-13]。值得注意的是，HO-1的誘導并不全是對機體有益的。有研究[14]表明HO-1的過表達可導致體外和體內模型中的肌肉損傷，導致骨骼肌萎縮，且HO-1的缺乏明顯減輕了肌肉萎縮。在睪丸組織中，HO-1在睪丸間質細胞中僅少量表達，而鎘應激誘導TM3細胞HO-1大量表達，提示其可能在其致睪丸的生殖毒性中發揮作用。在MA-10 Leydig腫瘤細胞中，HO同工酶降低了類固醇合成急性調節蛋白水平，并且氯化血紅素處理抑制了膽固醇向孕烯醇酮的轉化[15]。本研究結果表明，HO-1在鎘誘導的 TM3細胞中明顯表達并可能參與了睪酮分泌的抑制過程。