BOP1對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞遷移和侵襲的影響

張 娜，孔德潤(rùn)

胃癌是最常見(jiàn)的惡性胃腸癌之一，而我國(guó)是胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一[1]。胃癌患者死亡的主要原因是胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，通常在出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]，且患者術(shù)后五年生存率很低。了解胃癌病程進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)胃癌的早期診斷和治療非常重要。

增殖阻斷蛋白1(block of proliferation 1，BOP1)基因由Pestov et al[3]于1998年從小鼠cDNA文庫(kù)中克隆出的一種基因，其序列高度保守，位于人類(lèi)8q24.3[4]，屬于WD40蛋白家族[3]，與Pescadillo同源蛋白1(pescadillo homologue 1，PES1)和WD重復(fù)蛋白12(WD repeat domain 12，WDR12)形成穩(wěn)定的復(fù)合物PeBow Complex，參與核糖體60S亞基的成熟過(guò)程。目前研究[4-7]發(fā)現(xiàn)，BOP1的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。然而，BOP1與胃癌之間的相關(guān)性研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞BGC823作為模型，siRNA特異性結(jié)合BGC823細(xì)胞BOP1的mRNA并將其沉默，研究BOP1對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BOP1在人胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并通過(guò)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制BGC823細(xì)胞中BOP1的表達(dá)，探討B(tài)OP1對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年4月～2018年3月接受胃癌根治術(shù)的60例患者腫瘤組織和鄰近的非腫瘤組織。所有標(biāo)本都在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。每位患者均獲得知情同意書(shū)，研究方案已獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。手術(shù)前患者未接受過(guò)化療、放療或其他相關(guān)的抗腫瘤治療。人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1和胃癌細(xì)胞BGC823均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)。

1.1.2主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTMTransfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Dharmacon；siRNA購(gòu)自中國(guó)吉瑪公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-BOP1抗體、兔抗人GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃黏膜上皮細(xì)胞GES1和胃癌細(xì)胞BGC823在10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃下在含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)這些細(xì)胞匯合80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)時(shí)定量熒光PCR 采用TRIzol法提取組織和細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR循環(huán)擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參照。BOP1上游引物：5′-GAGTATGCGGAGGACAGCTC-3′，下游引物：5′-TGCTCATCCGTCAGTCTCAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，下游引物：5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3′。運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot 用含2%磷酸酶抑制劑混合物和1% PMSF的RIPA裂解液在冰上提取組織和細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品通過(guò)BCA法測(cè)定濃度并稀釋至相同濃度。將各組蛋白質(zhì)樣品與蛋白上樣緩沖液徹底混合后，將其在100 ℃下煮沸10 min以使蛋白質(zhì)變性并加入到SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離。濃縮分離后的蛋白移至PVDF膜上并用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。 在 4 ℃孵育一抗過(guò)夜，并用TBST清洗后再室溫孵育二抗(1 ∶2 000)1 h，TBST清洗4次(8 min/次)后顯影印跡。應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823細(xì)胞鋪在6孔板中過(guò)夜。將5 μl siRNA和195 μl不含血清的培養(yǎng)基混合液與5 μl DharmaFECTTM 轉(zhuǎn)染試劑和195 μl不含血清的培養(yǎng)基混合液各放置5 min后，再把這兩份混合液混合孵育20 min后加入6孔板中。實(shí)驗(yàn)選用3條BOP1-siRNA分別為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，用1條無(wú)任何靶基因的siRNA作為陰性對(duì)照(negative control，NC)，用1條GAPDH-siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照(positive control，PC)，不做任何處理作為空白對(duì)照(blank control,BC)，實(shí)驗(yàn)共分為6組，具體基因序列見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，分別用Real-time PCR和Western blot法檢驗(yàn)基因沉默效率。選擇具有最高沉默效率的BOP1-siRNA用于劃痕、Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

表1 小干擾RNA基因序列

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪在6孔板上并生長(zhǎng)至80%～90%融合換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用P-200一次性吸頭，將相同尺寸的劃痕施加于細(xì)胞單層，并用PBS洗滌兩次以除去細(xì)胞碎片。分別在0、24和48 h的劃痕時(shí)間點(diǎn)觀察和拍照以監(jiān)測(cè)傷口愈合過(guò)程，并收集圖像數(shù)據(jù)以分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。將600 μl含有15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液加入Transwell的下室，并將200 μl細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml的待測(cè)細(xì)胞加入到上室中。培養(yǎng)36 h后，用棉簽去除上室中的基質(zhì)膠，并用4%多聚甲醛溶液將黏附于Transwell小室膜下的表面細(xì)胞固定30 min。然后風(fēng)干，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，求其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠(Matrigel)和無(wú)血清培養(yǎng)基按1 ∶8稀釋并混合，在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室中包被50 μl稀釋的Matrigel。于37 ℃的培養(yǎng)箱中固化并放置一旁，其余的實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織及鄰近正常胃組織中BOP1的表達(dá)水平如圖1所示，Real-time和Western blot檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常胃組織中BOP1 mRNA及蛋白的表達(dá)。GraphPad Prism 6分析顯示，胃癌組織中BOP1 mRNA(t=2.990，P<0.05，圖1A)及蛋白(t=4.900，P<0.01，圖1B)的表達(dá)水平高于癌旁組織。

2.2BOP1在GES1及BGC823細(xì)胞中的表達(dá)水平與胃黏膜上皮細(xì)胞GES1相比，胃癌細(xì)胞BGC823中BOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為1.5倍和1.8倍。BOP1 mRNA(t=8.667，P<0.01，圖2A)和蛋白(t=19.68，P<0.01，圖2B)在胃癌細(xì)胞BGC823中的表達(dá)顯著高于胃黏膜正常細(xì)胞GES1。見(jiàn)圖2。

2.3siRNA靶向沉默BOP1基因的表達(dá)效果如圖3所示，按照DharmaFECTTMTransfection Reagent說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823，通過(guò)Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)BC組、si-NC組、si-GAPDH組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組mRNA和蛋白表達(dá)水平情況。檢測(cè)結(jié)果顯示：si-GAPDH組GAPDH mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于其他組。轉(zhuǎn)染48 h后si-RNA組中BOP1的mRNA(F=2 484，P<0.01，圖3A)及蛋白(F=1 533，P<0.01，圖3B)表達(dá)水平低于BC組、si-NC組和si-GAPDH組，其中siRNA-2組最明顯。選擇具有最高沉默效率的siRNA用于后續(xù)傷口愈合、Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

圖1 胃癌組織和鄰近正常胃癌旁組織中BOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2.4沉默BOP1基因?qū)?xì)胞遷移的影響在胃癌細(xì)胞BGC823沉默后，進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組細(xì)胞劃痕愈合率在24 h的平均數(shù)分別為(39.63±5.84)%、(44.11±4.84)%、(18.66±2.98)%，在48 h的平均數(shù)分別為(70.60±3.94)%、(64.94±3.31)%、(26.34±3.40)%，si-BOP1組的細(xì)胞劃痕愈合率在24 h 和48 h組明顯低于BC組和si-NC組，表明劃痕24 h 和48 h后 si-BOP1組的遷移能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=50.02，P<0.01；F=274.5，P<0.01)。

圖2 GES1細(xì)胞和BGC823細(xì)胞中BOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

圖3 轉(zhuǎn)染前后各組BGC-823細(xì)胞中BOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

圖4 沉默BOP1基因?qū)GC823細(xì)胞遷移的影響

2.5沉默BOP1基因?qū)?xì)胞遷移和侵襲的影響用沉默后的胃癌細(xì)胞BGC823做Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，如圖5所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組穿透Transwell基底膜的細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)分別為(573.50±23.05)、(555.80±32.12)、(88.83±28.52)，si-BOP1組穿透Transwell基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于BC組和si-NC組，表明si-BOP1組的遷移能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=572.2，P<0.01)。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)用于分析沉默胃癌細(xì)胞BGC823中穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量的差異。如圖5所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組細(xì)胞侵襲穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)分別為(604.30±29.53)、(618.00±41.96)、(115.80±27.18)，BC組和si-NC組細(xì)胞侵襲穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于si-BOP1組的細(xì)胞數(shù)，表明si-BOP1組的侵襲能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=436.9，P<0.01)。

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而持續(xù)的過(guò)程，涉及多種機(jī)制，其嚴(yán)重影響患者生命和治療效果[8]。雖然手術(shù)治療、化療和放療可以大大提高胃癌患者的生存率，但胃癌的早期癥狀并不典型，大多數(shù)患者在晚期被診斷為淋巴結(jié)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[9]。因此，對(duì)于胃癌早期病變指標(biāo)的探究和尋找胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力影響因素的研究尤為重要。

已有研究指出，BOP1在大腸癌[4-5]、肝細(xì)胞癌[6]和小鼠骨肉瘤模型中[7]過(guò)表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BOP1基因位于8q24.3，而8q24位點(diǎn)與多種腫瘤關(guān)系密切[10-11]。BOP1又是核糖體RNA前體向成熟RNA轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵分子，而核糖體合成異常在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。BOP1可促進(jìn)結(jié)腸直腸癌[5]和肝癌[6]中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。因此，本研究旨在探討B(tài)OP1在胃癌中的表達(dá)和作用。

圖5 BOP1沉默對(duì)BGC823細(xì)胞遷移和侵襲的影響 結(jié)晶紫染色×100

術(shù)后胃癌患者手術(shù)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示BOP1在胃癌組織中mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。siRNA是一種可以結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)并用Argonaute 2( RISC的催化核心)解開(kāi)siRNA雙鏈，轉(zhuǎn)錄后沉默目的基因的小干擾RNA[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，BGC823細(xì)胞中BOP1基因的表達(dá)被siRNA干擾；通過(guò)劃痕24 h組和48 h組與對(duì)照組相比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BOP1沉默組BGC823細(xì)胞遷移能力顯著下降，提示沉默BOP1基因具有抑制胃癌細(xì)胞BGC823遷移能力的功能；同時(shí)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示BOP1沉默組的遷移和侵襲能力顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明沉默BOP1基因顯著降低了胃癌細(xì)胞BGC823遷移和侵襲的能力。提示BOP1可能在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中具有重要作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中的關(guān)鍵媒介,其與胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14]。EMT是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要細(xì)胞黏附和形態(tài)的廣泛變化以及信號(hào)通路的激活。Chung et al[6]研究發(fā)現(xiàn)BOP1敲低的細(xì)胞中EMT的表型明顯消退，而上皮標(biāo)志物(E-鈣粘蛋白，細(xì)胞角蛋白18和γ-連環(huán)蛋白)的上調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物的下調(diào)提示BOP1可能是誘導(dǎo)EMT 的上游分子并激活RhoA鳥(niǎo)苷三磷酸酶(GTP酶)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Qi et al[5]證明Wnt /β-連環(huán)蛋白靶基因BOP1等過(guò)表達(dá)可降低結(jié)腸直腸癌(CRC)EMT發(fā)生的細(xì)胞黏附分子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)，促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移。E-鈣粘蛋白可以通過(guò)螯合β-連環(huán)蛋白(beta-catenin)與LEF(淋巴增強(qiáng)因子)/ TCF(T細(xì)胞因子)結(jié)合激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路[15]。提示BOP1可能激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，降低細(xì)胞相關(guān)黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。