葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混種對發酵枸杞果酒的影響

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(1.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室,寧夏銀川 750021;2.寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021;3.寧夏紅枸杞產業集團有限公司,寧夏銀川 750000)

枸杞屬藥食兩用植物[1],含有豐富的營養成分及生物活性物質[2],具有增強人體免疫力,以及抗衰老、防腫瘤等功效[3-5]。枸杞果酒是以寧夏枸杞果為原料,經酵母菌發酵制成的低度酒,較完整的保留了枸杞的主要營養成分[6]。

目前關于枸杞果酒的研究多集中于營養成分變化和生產工藝方面,有關枸杞果酒風味方面的研究報道較少,且均為商用酵母發酵研究。王琦等[7]采用HS-GC-MS法研究枸杞汁發酵前后香氣成分,結果表明發酵后的枸杞汁風味物質的種類和含量較枸杞原汁有所增加。湯衛華等[8]比較了5株活性干酵母和安琪酵母的發酵能力,綜合考慮發酵能力和枸杞酒樣香氣成分含量,最終選出一株酵母作為生產菌種。商用釀酒酵母具有較強的發酵能力,但產生揮發性香氣的能力不足[9]。大量研究表明,非釀酒酵母在葡萄酒釀制過程中,通過與釀酒酵母的共同發酵來控制酒體不理想的風味或者降低乙醇含量來賦予葡萄酒復雜的香氣,從而增加葡萄酒感官質量特征的復雜性[10-13]。其中葡萄汁有孢漢遜酵母產醋酸能力低,其產醋酸與乙酸乙酯的量與乙醇呈反向相關,可對葡萄酒感官結構具有很好的平衡作用;并且其分泌的糖苷酶具有葡萄酒增香釀造的應用潛力[14]。工業生產上,枸杞發酵前大多需通過清洗去除枸杞果表面大量農藥殘留,枸杞果表面的非釀酒酵母也損失不少。此外,考慮季節性因素,生產中還常使用干果復水的方法進行發酵。以上因素是造成枸杞果酒果香不突出、典型性欠佳的重要原因。

目前,非釀酒酵母在枸杞果酒釀制過程中的作用尚未見報道。本實驗重點研究葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母混種發酵枸杞酒。旨在通過對不同菌種、不同接種時間及不同接種比例探究枸杞果酒風味的變化,探討葡萄汁有孢漢遜酵母在枸杞酒發酵過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母AC(Saccharomycescerecisiae522 Davis) 法國Laffort公司;葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)GF-60、GF-85 本實驗室分離篩選,經ITS間區鑒定,并進行冷凍保藏;枸杞干果 寧夏紅枸杞產業集團有限公司。

GCMS-TQ8040三重四極桿型氣相色譜質譜聯用儀 日本島津公司;手動固相微萃取(SPME)裝置 美國supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞發酵酒的工藝流程及操作要點 本實驗按某企業干型枸杞果酒的生產工藝流程(圖1)進行操作,具體如下:

圖1 枸杞果酒發酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of wolfberry wine

操作要點:

干果復水:干枸杞和水按照1∶10的比例進行混合復水。

浸提:將復水好的液體煮沸30 min,冷卻后留清汁作為枸杞汁培養基備用。

預處理:30～40 ℃下,添加30 mg/kg果膠酶和50 mg/kg果汁復合酶進行酶解;酶解后的枸杞汁,添加40 mg/kg SO2處理。

調整成分:在枸杞汁中添加檸檬酸至酸度值為3 g/L;同時,為使目標酒精度在8.0%～10.0% Vol之間。在發酵前期和發酵中期分別補加白砂糖100和70 g/L。

酵母活化:將3種酵母菌分別接種于YPD培養基中活化。YPD活化培養基的制備:按1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖,95%蒸餾水配制活化培養基,115 ℃滅菌15 min。混菌發酵:采取清汁發酵的方式,分階段定量添加葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母,具體參數見1.2.2,發酵溫度設為20 ℃。

分離:當比重達0.992～0.996,殘糖低于4 g/L時發酵結束,采用虹吸法進行分離。

澄清過濾:抽濾機進行精濾。

理化檢測[15]:測定揮發酸、殘糖、酒度、總酸、游離SO2、總SO2。

1.2.2 發酵實驗 分別進行GF-60與AC,GF-85與AC不同接種比例、不同接種時間的混種發酵,總接種量為6%(v/v)。具體方法為將菌種于YPD液體培養基活化培養后,按體積比接種于枸杞汁中,間隔接種時需先接種GF-60或GF-85,一定時間后再接種AC。具體接種比例及接種時間發酵的酒樣編號見表1。同時對AC進行單獨發酵,編號為1#,發酵結束后進行感官和香氣及味道屬性的評定。結合理化指標,選取其中較好的組別進行后續放大實驗,并對揮發性成分進行分析。其中,接種實驗在200 mL三角瓶中進行,放大實驗在2000 mL三角瓶中進行。

表1 酵母菌混種發酵實驗設計Table 1 Experimental design of yeast mixed fermentation

1.2.3 感官評價 挑選9名在枸杞酒行業從業5年及以上的專業人員作為評定人員,其中4女5男,年齡在30～40歲之間。實驗在寧夏紅枸杞產業集團中寧枸杞制品有限公司的標準品酒室完成。品評杯具為透明郁金香酒杯,樣品隨機放置。品評者分別從色澤、香氣、口感及狀態方面對樣品打分。具體感官評價標準見表2[16]。

表2 枸杞果酒感官評價標準Table 2 Standards of sensory evaluation of wolfberry wines

1.2.4 香氣及味道屬性分析 對1.2.3中感官評價較好的樣品進行針對性的香氣及味道屬性評價。同樣挑選9名在枸杞酒行業從業5年的專業人員作為評定人員,4女5男,年齡在25～40歲之間。采用劉文麗[17]提到的定量描述分析(QDA)法對枸杞酒的5個主要香氣特征,即枸杞果香、甜香、生青味、醇香和發酵香;4個味道特征,即苦味、酸味、甜味、澀味進行定量描述分析,以10點制標度為描述標準。

1.2.5 理化指標的測定 對1.3.3中感官評價較好的樣品,根據GB/T-15038-2006[15]中描述進行理化指標的測定。具體檢測內容有:酒度、揮發酸、總酸、殘糖、游離SO2、總SO2。

1.2.6 揮發性成分分析 根據1.3.3及1.3.4結果綜合考慮選出較好組別進行枸杞酒揮發性成分的分析。

1.2.6.1 揮發性化合物的萃取 利用手動頂空固相微萃取(HS-SPME)法對枸杞酒樣品中揮發性物質進行富集,取20 mL頂空瓶,用無菌移液管加8 mL于40 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min,插入CAR/DVB/PDMS纖維頭40 ℃吸附15 min,GC解吸3 min,用于GC-MS分析。

1.2.6.2 氣相色譜質譜工作條件 色譜條件為:色譜柱為RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,再以8 ℃/min升至220 ℃,保持1 min。載氣為He,體積流量為1.40 mL/min,進樣口溫度為210 ℃。質譜條件為:EI 電離源,電子能量為70 eV,燈絲流量為0.20 mA。檢測器電壓為350 V。掃描范圍為20～450 AMU,離子源溫度為200 ℃。

1.3 數據統計分析

本實驗數據和圖采用Excel 2007進行計算。本實驗中檢測結果用SPSS 19軟件進行統計分析。質譜圖利用NIST 02譜庫進行檢索。

2 結果與分析

2.1 混菌發酵對產品感官品質的影響

19個樣品的感官評價結果見圖1。得分最高的樣品為11#(94分),即葡萄汁有孢漢遜酵母GF-85與釀酒酵母AC按3∶1的比例同時接種發酵的枸杞酒。該酒體色澤金黃、外觀澄清透明,光澤度高;酒香濃郁、香氣協調,具有清新的果香、醇香;味道酸甜協調,酒體豐滿,后味悠長;枸杞特征明顯,典型性突出。得分高于釀酒酵母AC單獨發酵的枸杞果酒有七組,分別為2#、5#、9#、10#、11#、14#、18#。

圖2 混種發酵枸杞果酒的感官評分Fig.2 The sensory scores of wolfberry wine with mixed fermentation

GF-60和GF-85與AC的比例和接入時間恰當時,所發酵的果酒感官質量優于AC單獨發酵的果酒。無論GF-60和GF-85與AC同時接種發酵,還是先接種GF-60或GF-85,間隔3 d后接種AC,樣品的感官評分都隨GF-60和GF-85接種比例的降低而下降。但先接種GF-60或GF-85,間隔6 d后接種AC,樣品感官評分先提高后下降,這可能與GF-60和GF-85的生長特性及其代謝產物對AC生長的影響有關。所有樣品在酒體色澤上得分較高(18～20分),都表現出良好的枸杞酒特有的金黃色,酒體透明度高;樣品在狀態(16～20分)上無混濁及沉淀或有少量沉淀物。差異主要表現在風味和口感上。不同酒樣差異較大。其中風味評分,最高分(18分)與最低分(12分)的差距有6分;口感評分,最高分(38分)與最低分(18分)的差距為20分。混菌發酵改變了產品的風味和口感,使不同樣品的酒體呈現很大差異。

2.2 不同酵母接種量及不同比例對產品香氣及味道屬性的影響

選擇得分高于1#(即釀酒酵母單獨發酵枸杞酒)酒樣的七組樣品進行進一步香氣及味道屬性的分析。不同酒樣的香氣與味道屬性平均得分表見表3,并形成相應的雷達圖(圖3)。

表3 不同比例及不同時間接種發酵的枸杞酒香氣與味道屬性得分表Table 3 Average scores of wolfberry wines with different inoculation time and ration from sensory analyses

圖3 混種發酵對枸杞果酒的香氣與味道屬性的影響Fig.3 Effects on of aroma and taste properties of wolfberry wine with mixed fermentation

香氣屬性方面,各樣品枸杞果香味不突出,其中1#釀酒酵母單獨發酵枸杞果香味得分最低。所有供試樣品的生青味較弱,這可能與發酵原料為枸杞干果有關。1#釀酒酵母單獨發酵枸杞酒的醇香最強烈,10#枸杞酒的醇香最寡淡。發酵香氣在各樣品間差異較大,11#得分最高,發酵香氣最濃郁,1#釀酒酵母單獨發酵枸杞酒得分最低。

味道屬性方面,各樣品都有著淡淡的后苦味,較弱的澀口感。總體而言,GF-85參與發酵的11#、14#、18#酒樣體現出酸甜適口偏酸的特點;而GF-60參與發酵的2#、5#、9#、10#及酒樣體現出酸甜適口偏甜的特點。11#和9#酒樣圓潤豐滿,酸甜適中,爽口,后味干凈,總體評價較優。14#、2#、18#入口較為純正,爽口,但醇厚感較弱,總體評價次之。AC單獨發酵的1#酒樣酒體較其它酒樣整體感覺較為單薄,寡淡。

綜合結果,最終選擇2#、9#、11#、14#、18#進行理化指標和揮發性成分檢測,與1#進行比較分析。

2.3 不同酵母接種量及不同比例對基本理化指標的影響

基本理化指標結果見表4。各酒樣的殘糖含量均在12 g/L以下,符合干型枸杞果酒的要求。酒精度在7.20%～9.30%,其中9#酒精度最高,11#酒精度最低。可見,產品酒精度除與釀酒酵母產酒精能力有關外,非釀酒酵母也在其間發揮著作用。混種發酵樣品的最終酒精度與非釀酒酵母菌種、混合比例、接種間隔時間均有關系,其間復雜的規律及機理有待進一步后續研究。

表4 不同枸杞酒樣品的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of wolberry wine samples

滴定酸的含量影響產品味道,揮發酸含量影響產品香氣。滴定酸含量在4.42～7.36 g/L,揮發酸含量在0.16～0.86 g/L,符合標準。樣品游離SO2含量在19.05～22.86 mg/L,總SO2含量在35.55～45.71 mg/L,符合國家標準。

2.4 揮發性成分分析

枸杞酒中的揮發性物質與枸杞汁本身及酵母發酵產生的代謝物有關。酵母菌不同、接種比例及接種時間的差異都會導致代謝物的差異。不同樣品的揮發性物質采用GC-MS分析,獲得的總離子流圖見圖4。所檢測到的質譜數據經過NIST標準譜庫檢索后,獲得不同樣品揮發性化合物的種類及相對含量見表5。

圖4 混種發酵枸杞果酒的GC-MS總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms of wolfberry wines with mixed fermentation

由表5可得,6個樣品共檢測出58種揮發性成分;其中酯類物質32種,醇類物質10種,烷烴類9種,醛類物質1種,酸類物質2種,酮類物質2種,其他化合物2種。

表5 不同枸杞果酒的主要香氣成分Table 5 Aromatic composition of different wolfberry wines

續表

酯類物質是構成枸杞果香的主要成分。與先前報道的鮮果生產的枸杞果酒中主要酯類物質不同[7-8],由干果復水發酵的枸杞果酒,無論AC單獨發酵還是AC與GF-85或GF-60混種發酵,辛酸乙酯(9.21%～17.22%)與癸酸乙酯(2.33%～1.50%)的相對百分含量較高,是枸杞酒樣的主要酯類物質。辛酸乙酯具有白蘭地酒香氣,癸酸乙酯具有果香和花香的香氣[18]。除辛酸乙酯與癸酸乙酯外,與AC單獨發酵相比,混種發酵產生了更高的己酸乙酯、3-甲基-乙酸丁酯和9-癸烯酸乙酯,這些物質產生不同的氣味[19],賦予了枸杞酒更加豐富的香氣。

除酯類物質外,醇類物質也是枸杞酒揮發性成分的重要組成部分。1,3-丁二醇(24.94%～51.49%)和異戊醇(7.97%～13.10%)是醇類中占比最高的成分,此外,還含有少量的2,3-丁二醇。其中異戊醇具有酒香和果香,1,3-丁二醇具有苦甜味,2,3-丁二醇具有黃油奶酪的味道。異戊醇不僅是鮮果生產的枸杞果酒中的重要物質[20],同時也是干果發酵酒樣中的重要物質。

烷烴類化合物雖檢測到的種類有9種,但其相對含量較低。加之烷烴香味閾值較高,一般被認為對風味物質的直接貢獻不大,其也可能是形成雜環化合物的重要中間體,有助于提高酒體的整體風味。

單獨發酵與混種發酵樣品的揮發性化合物統計分析結果見表6。結果顯示,接種了GF-60和GF-85的枸杞果酒酯類物質無論種類還是數量均高于AC單獨發酵的酒樣,其中18#酒樣的酯類物質多達23種,占比42.75%。AC單獨發酵的1#酒樣的醇類物質種類最多,相對含量最高,這是感官評價時1#酒樣的醇香壓過酒香的原因。其中高級醇和酯是發酵酒的主要香味和口味物質,能使酒體具有豐滿的香味和口味,并增加酒體的協調性。但含量太高會破壞酒體及風味的協調,給酒體帶來異香或異雜味[21]。各樣品混合發酵的醇類物質種類和占比均低于1#酒樣,但感官評價高于1#酒樣。原因可能與混合發酵的醇類物質與酯類物質含量恰到好處,使酒體更加協調。

表6 不同枸杞酒樣品中揮發性化合物統計結果Table 6 Statistical results of volatile compounds in different wolfberry wine samples

3 結論

本實驗研究了葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發酵對干性枸杞果酒品質的影響。使用釀酒酵母AC與葡萄汁有孢漢遜酵母GF-62或GF-85按不同比例,不同接種間隔時間進行發酵枸杞果酒。感官評價、香氣及味道屬性分析結果顯示接種比例及間隔時間恰當時,混種發酵枸杞果酒與釀酒酵母單獨發酵枸杞果酒相比,表現出更佳的感官品質。GC-MS法對揮發性成分分析顯示,接種了GF-60和GF-85的枸杞果酒其酯類物質種類和數量均高于AC單獨發酵的枸杞果酒,但AC單獨發酵的枸杞果酒醇類物質高于混合發酵枸杞果酒。

只要比例合適,接種時間恰當,先接種非釀酒酵母再接種釀酒酵母進行混合發酵,能更好的體現枸杞果酒的典型特征,改善枸杞果酒的品質和風味。本實驗的結果為高品質干型枸杞果酒的研發生產提供了有益的借鑒。