紅樹莓花色苷對D-半乳糖衰老模型小鼠的保護作用

, ,,Clint Taonaishe Chimbangu,,*

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.大連市農產品質量監測中心,遼寧大連 116037)

紅樹莓(RubusidaeusL.)懸鉤子植物,柔嫩多汁,香氣獨特。樹莓含有豐富的鐵、銅、鎂、鉀等微量元素及SOD、VE、VC和多酚等抗氧化類物質[1-2]?；ㄉ帐菢漭兄匾墓δ苄猿煞諿3],其含量遠高于蘋果、草莓、葡萄等水果[4]?；ㄉ站哂星宄杂苫?、抗炎、抗氧化、抗血栓,預防心血管疾病、抗癌、減肥、改善視力、延緩衰老等生理活性[5-6],目前對于抗氧化活性研究較為深入。樹莓花色苷有抗氧化、降血脂、抑菌活性,并對癌癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖[7-8]等具有預防作用。近些年來關于漿果類抗衰老方面的報道較多,例如沙棘、葡萄、藍莓、櫻桃等的多糖、色素、多酚等在延緩衰老、提高記憶力、增強機體體質等有很好的效果[9-12],同時發現樹莓糖蛋白[13]也有一定的抗衰老作用,但關于樹莓花色苷干預衰老過程研究并不多見,所以這為紅樹莓的加工利用提供了新思路。

衰老是由多方面因素相互作用的結果,表現為一系列機體變化和功能紊亂。通過持續注射一定量D-半乳糖模擬自然衰老過程,是公認的衰老研究的方法之一[14]。D-半乳糖在小鼠體內氧化產生大量自由基,迅速與細胞組分例如蛋白質、氨基酸、脂質等反應產生氧化產物,導致細胞膜通透性發生改變,使細胞代謝和功能形態發生改變,從而引起細胞衰老和死亡[14]。脂質過氧化作用還會導致膠原蛋白產生交聯,而使皮膚松弛、色素沉積等[15]。

因此本實驗預以D-半乳糖使小鼠為亞急性衰老模型,用紅樹莓花色苷(red raspberry anthocyanins,RRA)對其進行灌胃,通過觀察小鼠器官指數、抗氧化酶活力及心臟和腎臟結構形態變化,評價樹莓花色苷對機體衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹莓品種為費爾杜德(cv.Fertod Zamatos) 錦州七里河樹莓種植基地,無損果迅速去除田間熱、單體速凍后,置于-80 ℃冰箱中凍存備用;D-半乳糖粉劑 上海國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(VC) 濟南匯錦川化工有限公司;生理鹽水 江蘇蘇中藥業集團股份有限公司;甲醇 分析純,天津市大茂化學公司;SOD測試盒、CAT測試盒、GSH-Px測試盒、MDA測試盒、HYP測試盒 南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅染料 沈陽萬類生物有限公司;二甲苯 濟南匯豐達化工有限公司;SPF級雄性昆明(KM)小鼠60只 錦州醫科大學動物實驗中心,許可證號:SCXK(遼)2014-0004。

恒溫水浴鍋 上海雷韻試驗儀器制造有限公司;FA2104電子天平 上海雷韻試驗儀器制造有限公司;渦旋混合器 美國LABNET公司;高速組織搗碎機 上海標本模型廠;UV-1200紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;PHS-25 pH計 上海雷磁儀器有限公司;RE-1002旋轉蒸發器 西安禾普生物科技有限公司;DS-040ST功率可調超聲波清洗機 浙江東森電器有限公司;高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;組織研磨儀 上海凈信實業發展有限公司;組織包埋機 美國Thermo公司;CUT4062石蠟切片機 德國SLEE公司;光學顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹莓花色苷提取 紅樹莓凍果與含0.05% HCl的甲醇溶液[16]按質量與體積比1∶15室溫下用組織搗碎機破碎至無完整種子,再置于50 ℃、超聲功率為500 W超聲條件下提取1.5 h,抽濾去渣。重復超聲提取2次,合并濾液,過硅藻土去除脂溶性雜質,45 ℃旋轉蒸發至甲醇揮發完全,-80 ℃冷凍備用。

1.2.2 大孔樹脂AB-8純化紅樹莓花色苷粗提物 將1.2.1樣品用2 mol/L HCl調節pH2,濃度調節為上樣質量濃度2.3 mg/mL,上樣流速1.7 mL/min,上樣體積200 mL,樹脂動態吸附達到飽和狀態。60 mL 60%乙醇2 mL/min進行洗脫,45 ℃旋轉蒸發去除乙醇,-80 ℃冷凍備用?；ㄉ蘸繙y定[17]采用pH示差法:

花色苷含量(mg/100 g)=[(A515-A700)pH1-(A515-A700)pH4.5]×MW×DF×1000×V/(ε×1×m)×100

式(1)

式中:A515和A700分別為515和700 nm處的吸光度;MW為相對分子質量,以矢車菊-3-葡萄糖苷為標準449.4;DF為稀釋倍數;ε為消光系數,26900 L·cm-1·mg-1;1為光程(1 cm)。V為提取液的總體積(mL);m為樣品的質量(g)。

1.2.3 動物分組及給藥 選擇健康昆明小鼠60只,適應性飼養7 d,隨機分6組:空白對照組、D-半乳糖模型組、VC陽性對照組、紅樹莓花色苷低劑量組(RRA-L)、中劑量組(RRA-M)和高劑量組(RRA-H),每組10只。于每日下午2點,空白對照組頸背部注射生理鹽水,其余各組注射D-半乳糖400 mg/kg;空白對照組和模型組灌胃雙蒸水,陽性對照組灌胃VC溶液100 mg/kg,花色苷低、中、高劑量組分別灌胃花色苷含量為20、100、500 mg/kg體重。每天進行注射及灌胃給藥,持續8周。每周稱量體重一次,調節注射及灌胃劑量。

1.2.4 檢測樣品的采集 末次給藥,禁食24 h,自由飲水,并用10% Na2S涂于各組小鼠背部兩肩胛處皮膚脫毛。第二天摘眼球取血(斜面靜置20 min,于4 ℃、2000 r/min,離心10 min,取上清,即為血清),斷頸處死,剪下脫毛皮膚,表2～表4同。鋪平用打孔器取4塊直徑為1.4 cm左右的皮膚(去除結締組織和皮下脂肪),并取心臟、肝臟、腎臟、胸腺和脾臟組織,剔去周圍結締組織。

表4 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠皮膚SOD、CAT、GSH-Px活力和HYP含量的影響Table 4 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of HYP in skin of mice

表2 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in liver of mice

1.2.5 器官指數的測定 將胸腺、脾臟、肝臟和腎臟組織于4 ℃生理鹽水中洗去浮血,濾紙吸干水分,稱重,計算器官指數:

器官指數(mg/g)=器官質量(mg)/小鼠體重(g)

式(2)

1.2.6 生化指標的測定 按照試劑盒測定血清和肝臟組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;檢測皮膚SOD、CAT、GSH-Px活性和羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。

1.2.7 組織切片觀察 取小鼠心臟和腎臟組織,置于福爾馬林中固定,再經過80%、90%、95%、100%梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機切片,蘇木素-伊紅染色,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察變化情況。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠器官指數的影響

由表1可知，與空白對照組相比,模型組的胸腺指數、脾臟指數顯著降低(p<0.05),模型組小鼠胸腺和脾臟萎縮,說明造模成功。脾臟和胸腺作為生命體重要的免疫器官,隨著生命體的衰老,胸腺和脾臟出現體積縮小、功能減退,生命質量下降[18-19]。與模型組相比,樹莓花色苷各劑量組胸腺和脾臟指數都有所提高,RRA-L胸腺指數提高,但差異不顯著(p>0.05),RRA-M胸腺指數極顯著提高(p<0.01),RRA-H胸腺指數顯著提高(p<0.05);RRA-L脾臟指數與模型組比較顯著提高(p<0.05),RRA-M、RRA-H脾臟指數與模型組比較極顯著提高(p<0.01)。RRA-L、RRA-M、RRA-H胸腺指數和脾臟指數與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),說明對于胸腺和脾臟指數而言,紅樹莓花色苷延緩衰老作用與VC接近。肝臟指數和腎臟指數較模型組都有一定的提高,但是結果差異不顯著(p>0.05)。

表1 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠器官指數的影響Table 1 Effect of RRA on organ indexes of mice

2.2 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響

2.3 樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力及對MDA含量的影響

根據表3,小鼠血清情況:模型組各種酶活性顯著低于空白對照組(p<0.05),MDA含量模型組顯著高于空白對照組(p<0.05)。RRA-L中SOD活性顯著高于模型組(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT活性顯著高于模型組(p<0.05),GSH-Px活性極顯著高于模型組(p<0.01),MDA含量顯著低于模型組(p<0.05);RRA-H的SOD、GSH-Px活性極顯著高于模型組(p<0.01),MDA含量極顯著低于模型組(p<0.01)。另外,RRA-H中SOD、CAT和GSH-Px活性顯著高于陽性對照組(p<0.05),RRA-M中CAT活性和RRA-H中MDA含量與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),說明高劑量的紅樹莓花色苷對衰老小鼠保護作用良好。在以往研究中發現:將“黑美人”土豆花色苷、黑米花色苷及黑豆花色苷[23-25]作用于衰老小鼠,結果都顯示小鼠血清及器官中SOD、GSH-Px活性顯著提高,MDA含量下降,有本實驗有著類似的結果。

表3 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 3 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in serum of mice

2.4 樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠皮膚SOD、CAT、GSH-Px活力及對HYP含量的影響

根據表4,模型組各酶類活性顯著低于空白對照組(p<0.05),HYP是膠原纖維和膠原蛋白中主要的非必需氨基酸[26-27],是檢測機體膠原代謝的重要指標,也是評價皮膚衰老的重要指標。HYP含量可以間接反映真皮內膠原蛋白含量的變化情況。與空白對照組相比,模型組SOD、CAT、GSH-Px活性和HYP含量顯著降低(p<0.05);RRA-L中SOD、GSH-Px活性和HYP含量顯著高于模型組(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著高于模型組(p<0.05),HYP含量極顯著高于模型組(p<0.01);RRA-H中SOD、CAT活性和HYP含量極顯著高于模型組(p<0.01),另外RRA-H中CAT、GSH-Px活性及HYP含量與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),SOD活性甚至優于VC陽性組作用(p<0.05),說明紅樹莓花色苷對延緩皮膚衰老、增加皮膚彈性起到一定的作用。與本結論類似的研究有:黑果腺肋花楸花色苷對紫外輻射所致人皮膚成纖維細胞有保護作用[28],黑果枸杞原花青素和紫薯花色苷[29-30]都可以修復皮膚氧化損傷。另外關于植物花色苷延緩衰老的研究還有:周波[31]等利用玉米紫色色素研究對黑腹果蠅影響,發現其延長黑腹果蠅壽命、增加最高壽命,并提高體內SOD活性;李亞巍[32]發現越橘花色苷對衰老小鼠學習記憶能力有提高作用。這說明植物花色苷在預防衰老方面有很廣闊的前景,為紅樹莓資源的開發利用及消費者健康生活提供了更多的選擇。

2.5 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠心臟組織的影響

圖1a所示,正常心肌細胞數量多,排列規則,形態大小正常,細胞核呈卵圓形,核仁清晰,肌漿呈粉紅色;圖1b中模型組心肌細胞細胞明顯減少,有出血點、見輕度固縮狀細胞核,在組織中分布不均勻,有空泡;圖1c中陽性對照組心肌細胞形態接近于空白組,排列整齊,細胞數量多;圖1d、1e、1f中,低、中、高組小鼠較模型對照模型組有很大的改善,有少量出血,細胞排列混亂,心肌細胞呈短柱狀、有分叉,細胞結構清晰,細胞數量增加。結果說明紅樹莓花色苷能緩解心臟衰老,對心肌細胞氧化損傷具有預防作用。

圖1 小鼠心臟組織切片(HE,×400)Fig.1 Histopathology of heart tissues(HE,×400)注:a～c分別為:空白對照組、模型組、陽性對照組;d～f分別為:RRA-L組、RRA-M組、RRA-H組,圖2同。

2.6 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟組織的影響

如圖2a所示,正常腎小球分布密集,圓形或橢圓形,外觀規整,腎小囊囊腔正常,腎小管管腔正常。在圖2b中模型組腎小球體積增大,分布稀少,不規整,腎小囊囊腔明顯增大,基底膜增厚,腎小管管腔增大,結構不清晰。圖2d、2e、2f各劑量組相比于模型組腎小球數量明顯增多,腎小囊囊腔有所減小,基底膜增厚不明顯。隨著劑量的增加,花色苷對于衰老損傷的腎細胞具有修復作用越來越好,本實驗說明紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟損傷具有抑制作用。

圖2 小鼠腎臟組織切片(HE,×400)Fig.2 Histopathology of kidney tissues(HE,×400)

3 結論

本研究通過注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,觀察紅樹莓花色苷對衰老的干預作用。結果表明:紅樹莓花色苷對衰老造成的胸腺和脾臟指數的下降有一定的改善作用,使衰老小鼠肝臟和血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著提高(p<0.05)、降低MDA含量(p<0.05),同時也顯著提高皮膚組織中SOD、CAT、GSH-Px活力及HYP含量(p<0.05),對改善皮膚衰老狀況起到積極的作用;通過病理切片觀察到,紅樹莓花色苷對心肌細胞氧化損傷起到緩解作用,使小鼠腎小球結構逐漸恢復接近于正常狀態,結構規整、數量增加,腎小管結構清晰,說明紅樹莓花色苷對于自由基造成的衰老有一定的抑制作用。