ZNF217在肝細胞癌中的表達及對腫瘤侵襲的影響

姜業臻 李 超 王宇峰 涂康生 劉青光

我國是世界上原發性肝癌發生率及死亡率最高的國家之一[1]，其中主要的病理類型為肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。高侵襲性導致的腫瘤腹腔播散及多器官轉移是導致HCC患者總體生存率較低的主要原因[3]。

在哺乳動物細胞內具有大量含有鋅指結構的轉錄因子，盡管這些轉錄因子內鋅指結構的氨基酸序列相似，但每種轉錄因子卻具有獨特的蛋白構象及生物學功能[4]。鋅指蛋白217(zinc finger protein 217，ZNF217)是1種位于細胞核內的kruppel樣鋅指結構轉錄因子，其表達水平在結腸癌[5]及卵巢癌[6]中均出現異常升高，并與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲特征密切相關，提示ZNF217可能是1種新的腫瘤標志物及分子治療靶點。本課題旨在通過檢測ZNF217在肝癌組織中的表達，分析其與患者腫瘤臨床特征之間的關系以及對肝癌細胞侵襲能力的影響及其分子機制，以期為研究ZNF217作為抗HCC侵襲轉移治療靶點提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

于我院肝膽外科標本庫整理收集在2013年1月1日至2015年1月1日間行手術切除的HCC及癌旁組織標本50例，包括男性38例，女性12例，患者年齡50～71歲，中位年齡56歲。鼠抗人SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。人永生化肝細胞LO2及肝癌細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721及MHCC97-H均由我實驗室保存。鼠抗人ZNF217單克隆抗體(NBP2-46424)購自美國Novus公司；鼠抗人GAPDH(#5174)、E-cadherin(#14472)單克隆抗體及兔抗人Vimentin(#5741)單克隆抗體均購自美國CST公司。DMEM液體培養基及胎牛血清均購自美國Gibco公司。RNA提取試劑Trizol(#15596026)、轉染試劑LipofectamineTM3000(#L3000015)及RT-PCR試劑盒(#10928042)均購自美國Invitrogen公司。SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(#1725120)購自美國BIO-RAD公司。Transwell小室(#3458)購自美國CORNING公司。人工基質膠(#354230)購自美國B&D公司。ZNF217引物(上游5'-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3'；下游5'-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3')，GAPDH引物(上游5'-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3'；下游5'-GGACTCCACGACGTACTCA-3')由上海生工生物工程公司合成。ZNF217 siRNA(sc-63249)及陰性對照siRNA購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 福爾馬林液固定-石蠟包埋的組織切片常規脫蠟、水化及微波抗原修復，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用鼠抗人ZNF217抗體按1∶100稀釋比例浸沒組織標本，4 ℃搖晃、孵育過夜。洗凈未結合一抗后，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗結合相應一抗，DAB法顯示陽性蛋白。按如下方法計算切片染色得分：無陽性染色細胞為0分，陽性染色細胞數<25%為1分，25～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。

1.2.2 細胞培養及qRT-PCR 人永生化肝細胞LO2及肝癌細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721及MHCC97-H培養于適宜環境中，穩定傳代2～3代。按Trizol說明書指示提取細胞總RNA。每樣本取等量RNA配制20 μl的逆轉錄反應體系合成cDNA。cDNA稀釋10倍后取5 μl配制Real-time PCR體系，按如下條件進行PCR反應：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環。以GAPDH作為內參，采用2-△△Ct法計算ZNF217 mRNA的相對表達量。

1.2.3 細胞siRNA轉染 MHCC97-H細胞以過夜培養達50%～70%之密度接種于6孔板中。ZNF217 siRNA轉染分組：陰性對照組(si-Control)每孔加入75 pmol的陰性對照siRNA及7.5 μl轉染試劑，ZNF217組每孔加入75 pmol的ZNF217 siRNA及7.5 μl轉染試劑；以無血清DMEM培養基調整終體積為2 ml/孔。轉染48 h后進行下一步試驗。

1.2.4 Transwell侵襲小室模型 用無血清DMEM培養基按1∶8比例稀釋50 mg/l的基質膠100 μl/孔覆蓋transwell小室上室面，于37 ℃細胞培養箱內風干1 h后備用。取轉染48 h后的MHCC97-H細胞用無血清DMEM培養基重懸，以2×105/ml的密度每孔加入100 μl的細胞懸液。24孔細胞培養板內每孔加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基。將小室放于24孔板中繼續培養24 h。PBS清洗小室、4%多聚甲醛固定，并用0.1%的結晶紫染色10 min。擦除上室面未成功侵襲過小室膜的細胞，顯微鏡下觀察并計數下室面細胞數目。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測 MHCC97-H細胞轉染72 h后，以RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白并均值化每樣本蛋白量。4%～20% SDS-PAGE凝膠每孔加入15 μl蛋白樣品，垂直電泳分離蛋白。100 V轉膜2 h之條件將目的蛋白轉移至NC膜上。5% BSA室溫封閉1 h后按1∶1 000比例4 ℃孵育ZNF217、E-cadherin、Vimentin及GAPDH一抗過夜。PBS洗去未結合一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔二抗室溫孵育NC膜1 h。于暗室內，ECL法觀察蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ZNF217在肝癌組織中的表達情況

經免疫組化檢測發現，ZNF217主要表達于細胞核及細胞質中。統計學分析表明，HCC組織中的ZNF217的免疫組化評分(2.53±0.31)顯著高于癌旁組織評分(1.03±0.33)(P=0.007)。

2.2 肝癌中ZNF217表達與其臨床病理特征的關系

50例HCC患者分為ZNF217高表達組(n=32)和ZNF217低表達組(n=18)。高表達ZNF217患者其臨床TNM分期較低表達ZNF217的患者更晚(χ2=5.223，P=0.022)，見表1。

表1 ZNF217表達與肝癌臨床特征的相關性/例

注：*為P<0.05。

2.3 siRNA沉默MHCC97-H細胞中ZNF217表達

以LO2中ZNF217 mRNA的表達水平標準化4種肝癌細胞中ZNF217 mRNA的表達水平后發現，除HepG2細胞外，ZNF217 mRNA在其余3種肝癌細胞中的水平均顯著高于LO2細胞，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1A)。向ZNF217 mRNA表達量最高的MHCC97-H細胞內轉染入ZNF217特異性siRNA。qRT-PCR及蛋白免疫印跡檢測結果證實，siRNA轉染下調了MHCC97-H細胞中ZNF217 mRNA(1.00 vs 0.31±0.10，P=0.008，圖1B)及蛋白(0.61±0.11 vs 0.17±0.09，P=0.030，圖1C)的表達水平，成功建立了肝癌細胞ZNF217敲除模型。

2.4 下調ZNF217的表達抑制MHCC97-H細胞侵襲及EMT現象

如圖2A所示，下調ZNF217表達后，侵襲至小室下室面的細胞數目較對照組明顯減少[(48.81±7.11)vs (17.42±8.02)，P=0.024，圖2B)]。上皮-間質化轉變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞侵襲能力發生變化的眾多分子機制之一。如圖2B所示，沉默ZNF217后MHCC97-H細胞內E-cadherin蛋白表達水平顯著提高[(0.31±0.07) vs (0.78±0.11)，P=0.039)]，而Vimentin表達水平顯著降低[(0.39±0.05)vs (0.09±0.05)，P=0.011)]。

A為不同肝癌細胞中ZNF217 mRNA相對表達量；B為siRNA沉默MHCC97-H細胞內ZNF217 mRNA的表達；C為siRNA沉默MHCC97-H細胞內ZNF217蛋白的表達。

A為沉默ZNF217抑制MHCC97-H細胞的侵襲數目；B為沉默ZNF217對MHCC97-H細胞內E-cadherin及Vimentin表達的影響。

3 討論

ZNF217位于人類染色體20q13區域，這一區域的基因在人類腫瘤中常常出現異常擴增[7]。目前研究結果[8]也表明，ZNF217也是1種具有促癌作用的蛋白，并且在不同的腫瘤類型中存在異常表達并具有多樣化的生物學功能。

首先，ZNF217在包括乳腺癌[9]和前列腺癌[10]在內的多種腫瘤中的表達異常升高，且高表達ZNF217的患者手術后或者化療后的無病生存率和總生存率較低表達ZNF217的患者更低。在本研究中，我們通過檢測50例肝細胞癌組織中ZNF217的表達水平顯著高于癌旁組織，高表達ZNF217的患者臨床分期(TNM分期)更晚，提示這部分患者預后不良。但是，由于長期隨訪未完成，我們暫不能得出肝癌組織中ZNF217的表達與患者臨床預后間的確切關系，這需要在今后的研究工作中進一步完善。

其次，有證據表明，在卵巢癌[11]及乳腺癌[12]中，ZNF217能夠通過持續激活PI3K/Akt及MAPK信號通路維持腫瘤細胞的增殖狀態。除此之外，ZNF217還能通過與CoREST形成轉錄抑制復合物來阻滯細胞周期抑制因子p15ink4b的轉錄，從而使更多的腫瘤細胞處于DNA復制的S期[13]。但是，ZNF217對于腫瘤細胞侵襲及EMT形成的作用尚不完全明確。在本研究中，我們通過小RNA干擾技術在肝癌細胞中下調ZNF217的表達后，通過transwell侵襲小室模型證實MHCC97-H細胞的侵襲能力受到抑制，創新性的證明了沉默ZNF217表達能夠發揮一定的抗腫瘤侵襲作用。上皮間質化轉變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是改變腫瘤細胞侵襲能力的重要分子機制之一[14]。目前已確證，Snail、Slug及TWIST等轉錄調節因子均能夠促進肝癌細胞EMT現象的發生，而這些轉錄因子與ZNF217相似，均具有鋅指結構[15]。在本研究中，我們通過蛋白免疫印跡檢測證實，在下調ZNF217后，MHCC97-H細胞中上皮標志物E-cadherin的表達顯著升高而間質標志物Vimentin的表達顯著下調。因此，我們推測ZNF217促進肝癌細胞侵襲可能是通過促進肝癌細胞EMT而實現的。

綜上，ZNF217在肝癌組織中表達異常升高，其作為一種癌蛋白，在促進腫瘤侵襲方面具有重要作用。