交叉等溫擴增技術快速檢測幽門螺桿菌方法的建立

劉文鑫 袁超文 王瑩瑩 馮瑜菲

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.Pylori）是一種全球最常見的寄生于人類胃黏膜的革蘭氏陰性微需氧菌，被世界衛生組織國際癌癥研究機構（WHO/IARC）定義為I類致癌因子，也是引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病的主要因素[1-2]。在世界范圍內大約50%以上的人口感染Hp，尤其在發展中國家和不發達國家地區感染率更高[3]，我國Hp的總感染率調查結果顯示，我國人群總感染率高達50% 左右，且流行發病率呈逐年增高趨勢[4]。Hp的毒力因子主要包括細胞毒素相關基因（cagA）、空泡毒素基因（vacA）和尿素酶基因（ureA、ureB）和磷酸葡萄糖氨基轉移酶基因（ureC）等，尿素酶基因為H. pylori感染的首要因素，可通過定植胃黏膜上皮細胞并刺激分泌細胞因子誘發炎癥反應[5]。目前，對于幽門螺桿菌的檢測手段主要包括侵入性檢測（內鏡成像、病理組織學檢查、快速脲酶試驗等）和非侵入性檢測（尿素呼氣試驗、糞便抗原檢測和血清學檢測等）[6]，但每種方法都存在著其各自的優缺點和臨床應用的限制，如快速尿素酶試驗會對胃黏膜造成損傷，且不適用于凝血功能差或服用抗凝藥物的患者[7]。UBT 被認為是目前診斷幽門螺桿菌的“金標準”，但檢測耗時長、成本較高[8-9]。分子生物學（如real-time PCR法）可被用來快速檢測H. pylori，但其應用大多需要昂貴儀器，限制了在基層醫院和防疫部門推廣。因此，快速、低廉、高效地檢測H. pylori感染對公共醫療事業具有重要意義。與傳統的分子生物學檢測方法相比，等溫擴增技術可通過具有鏈置換活性的聚合酶和特異性引物在恒定溫度下完成快速擴增，因其操作簡便、快速準確且無需昂貴設備儀器等優勢，現已被廣泛用于醫學檢驗等方面[10-11]。本研究應用一種新的交叉引物等溫擴增技術（Cross-priming amplification，CPA），針對幽門螺桿菌尿霉素B基因（UreB）設計特異性引物建立一種無創、高特異性和靈敏性的快速檢測方法，可為基層醫療單位和防疫部門提供操作更為簡單的快速診斷方法。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、試劑與儀器

DNA提取試劑盒（TAKARA）、dNTPs（TansGen）、甜菜堿（Sigma-Aldrich）、瓊脂糖（Wissen）、Bst DNA聚合酶（New England Biolabs）、反應引物（上海生工生物工程公司合成）；電泳儀（北京六一）、凝膠成像系統 2500R （Tanon）、濁度儀（HACH）、臺式高速離心機（Eppendorf）、電熱恒溫水浴鍋（歐萊博 H-W420）。

菌株采用2株幽門螺桿菌及7株其他相關陰性菌：幽門螺桿菌ATCC 26695、ATCC 43504、小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、大腸桿菌ATCC 43886、副溶血性弧菌ATCC 27519、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、腸出血性大腸桿菌ATCC 35150均為本研究室保存。

1.2 引物設計

以幽門螺桿菌的尿霉素B基因（UreB）序列（GenBank登錄號：AY714224.1）為靶基因，設計3套CPA特異性引物（分別命名為HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3），序列見表1。

表1 幽門螺桿菌CPA擴增引物

1.3 模板DNA的制備

使用DNA提取試劑盒提取幽門螺桿菌DNA基因組，具體方法見試劑盒說明書。

1.4 反應的體系建立與優化

首先對3套CPA特異性引物進行驗證，反應體系25 μL包含：2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、20 mmol/L MgCl22.5 μL、10×bst Buffer 2.5 μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL、8 U Bst DNA聚合酶、待測樣品基因組 DNA 2 μL。HCPA-1、HCPA-2和HCPA-3引物量分別為：F1為5 μL，F5F/F5B各2 μL，F3/B3各0.5 μL，以上引物濃度均為10 μM，并在60℃恒溫條件下每隔3 min取樣一次，連續孵育72 min，擴增結果用濁度儀于650 nm處進行測定。

為確定CPA最佳的反應溫度、Bst DNA聚合酶濃度和反應時間，每個反應均需重復三次，選擇上述建立的擴增最好的特異性引物分別對反應溫度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃）、Bst DNA聚合酶濃度（6 U、8 U、10 U和12 U）、以及反應時間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min），反應結果用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5 特異性試驗

本研究共使用9株實驗菌（2株幽門螺桿菌和7株其他致病菌）進行特異性檢測，同時設定不添加模板的陰性對照并與PCR法比較，擴增產物均用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.6 靈敏度試驗

取幽門螺桿ATCC 26695菌液1 mL進行平板計數，經測得初始菌液濃度為1.26×108cfu/mL，PBS對菌液10倍倍比稀釋至1.26×102cfu/mL，隨后調整50 cfu/mL和25 cfu/mL共9個稀釋度。分別吸取2 μL稀釋后的菌液作為模板進行靈敏度試驗，試驗重復三次。

1.7 臨床組織樣本檢驗

對2017年7月—2018年6月收集的75例臨床胃黏膜組織樣本，進行13C-尿素呼氣試驗（13C-UBT）法檢測，其診斷結果作為參照標準，隨后進行CPA擴增檢測，擴增產物用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 統計學處理

應用 SPSS 17.0 統計分析軟件對檢測結果進行分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CPA方法的建立與優化

本研究設計的3套CPA特異性引物均具有良好的特異性，但HCPA-3的擴增效果最佳，可在60℃條件下完成對UreB基因的大量擴增（見圖1A）。隨后對HCPA-3特異性引物的反應溫度、Bst DNA聚合酶濃度和擴增時間分別進行了優化，結果表明：反應溫度在62℃、Bst DNA聚合酶濃度為6 U、孵育時間于60 min時擴增效率為最高（見圖1B-D）。

2.2 特異性試驗

用上述優化的CPA方法分別對9株不同的致病菌進行特異性試驗，需重復三次。2%瓊脂糖電泳結果顯示，其中2株幽門螺桿菌擴增結果均為陽性，其余7株陰性相關擴增結果均為陰性，且與PCR方法檢測結果相同，說明CPA法特異性較高，且對幽門螺桿菌檢測具有很好的通用性（見圖2）。

2.3 敏感性試驗

將過夜培養的純菌液由1.26×108cfu/mL依次10倍稀釋至1.26×102cfu/mL，隨后稀釋50 cfu/mL和25 cfu/mL共9個稀釋度進行敏感性試驗。反應結果如圖3所示，CPA方法檢測的靈敏度達1.26×102cfu/mL。

2.4 臨床胃黏膜組織樣本檢測結果

對收集的75例臨床胃黏膜組織樣本進行13C-尿素呼氣試驗（13C-UBT）檢測作為“金標準”，共檢測出H. pylori陽性27株，陽性檢出率為36.0%；而CPA法共檢測出H. pylori陽性26株，陽性檢出率為36.67%，檢測靈敏度達96.30%（26/27），且兩種方法的陽性檢出率差異無統計學意義（P=0.53）。

3 討論

圖1 CPA特異性引物的篩選與優化

圖 2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

幽門螺桿菌在全世界各地人群中感染率均較高，并與年齡、種族、性別和地理分布等因素密切相關，發展中國家的患病率高達50%～70%[12]，故研究者不斷開發各種診斷幽門螺桿菌的技術，以尋找一種快速、簡單、高特異性的診斷方法。傳統的H. pylori診完成對UreB基因的大量擴增。特異性試驗結果顯示，HCPA-3特異性引物的通用性較好，不識別其他非幽門螺桿菌，但本研究選用的其他致病菌種類較少，導致特異性試驗結果較為局限，應在下一步的研究中加以完善。敏感性實驗結果顯示，CPA法的檢測極限為1.26×102cfu/mL，與之前報道的Realtime PCR方法的靈敏度相近，可滿足低濃度目的基因的檢測。通過對75例臨床胃黏膜組織樣本檢測，同“金標準”13C-尿素呼氣試驗法檢測結果相符，其準確率為96.30%（P＞0.05）且無假陽性出現。由此可見，CPA法檢測幽門螺桿菌的靈敏度和特異度均較高，能夠快速、準確和高效的完成對H. pylori感染的診斷。

CPA法雖在實際應用中對設備的依賴性比PCR或real-time PCR法更為簡單，但在擴增過程中會合成大量的DNA，形成的氣溶膠斷檢測主要以“金標準”UBT法為代表，但對于已接受胃鏡檢查的患者，再進行UBT 檢測則增加了時間和經濟成本。近年來，以PCR法為代表的分子生物學技術作為一種重要的基因診斷方法克服了操作繁瑣、耗時較長的缺點，并在許多領域得到了迅速的應用與發展，Real-time PCR常被用于檢測組織樣本中DNA含量[13]，但該方法的開展需要專業操作人員和高昂的檢測設備，對很多條件簡陋的臨床醫學實驗室來說這依舊是個難題。

CPA 是一種近年新出現的等溫擴增技術，其原理與環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相似，現已成功應用到多種細菌和病毒的核酸檢測當中[14]。本研究針對幽門螺桿菌UreB基因設計特異性引物，并優化反應溫度、Bst DNA聚合酶濃度、反應時間等參數，成功建立了一種快速、簡單的新型檢測技術，從加樣到反應結束整個過程可在1.5h內易對周圍環境造成污染，所以在配置體系時應防止DNA模板和反應試劑污染，避免形成假陽性結果。向反應體系內加入核酸染料，利用顏色的變化判定檢測結果，但在反應結束后開蓋一樣不能避免氣溶膠造成的污染，開發封閉防污染的試紙條雖然可以解決上述問題，但由于專利保護的限制，加大了開發的難度。因此，對于等溫擴增技術還應不斷地探索與完善，尋找更多解決問題的方法。

綜上所述，本研究建立的CPA快速檢法，不僅具有時間短、低成本、檢測效率高的特點，且不需要依賴昂貴的儀器設備和專業的操作條件，為基層醫院和防疫部門檢驗幽門螺桿菌性感染提供一種新的思路。