藥品檢驗常用標準菌種的斜面保藏方法研究

戴宇婷 劉自昭

標準菌種（如CMCC或ATCC）是經過準確鑒定的分離的菌株，由國內或國際菌種機構保藏的遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌種[1]。標準菌種是微生物檢測中必不可少的標準物質，對評價檢測方法、校準儀器設備、檢測能力驗證、培養基和檢測試劑的質量控制、檢測過程和結果的評價都有著重要作用[2]。據2015版《中國藥典》，標準菌種在檢驗過程中、陽性對照試驗、培養基適用性檢查、方法適用性試驗等方面都有使用，并有詳細要求。因此標準菌種在藥品檢驗中有著重要作用。標準菌種的保藏是微生物學檢驗工作中的一項重要工作，需保證其生物學特性，減少污染和生長特性的改變。2015版《中國藥典》要求菌株的傳代次數不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存[3]。不良的方法會導致菌種發生老化、退化、變異、污染等情況[4]。常用的保藏方法有很多，如斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、冷凍真空干燥保藏法等。根據不同的菌種保藏方法也不同，以保證其生物學特性不變，同時還要考慮使用的范圍、設備的情況、操作的簡便性、方法的通用性等。其中斜面低溫保藏法作為短期保藏的方法最常用，其操作簡便，存活率高，適用菌系范圍比較廣，簡單易行，便于操作和觀察，成本比較低[5]。但保藏時間較短，轉管次數多，不適于長期保藏[6]，易被污染變異。因此，有必要對此方法保藏不同菌種的條件、期限、方法等進行驗證試驗。為菌種管理的程序化標準化提供依據，保證操作的統一性，為試驗結果的一致性提供保障。

1 試驗材料

1.1 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA（批號：1612232）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基SDA（批號：160913）均為北京三藥科技開發公司產品，并經過適用性檢查。

1.2 菌種

中國食品藥品檢定研究院：白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102 ]、乙型副傷寒沙門氏菌[CMCC（B）50 094]、短小芽孢桿菌[CMCC（B）63 202]、藤黃微球菌[CMCC（B）28 001]。

1.3 儀器設備

壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-75G（上海博迅實業有限公司），生化培養箱LRH-250F（上海一恒科技有限公司），生物安全柜BHC-1300ⅡA2（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），鼓風電熱干燥箱GZX-9246MBE、電子天平ML503 /02[梅特勒-托利多（上海）公司]，全自動微生物分析系統儀VITEK2 Compact（法國梅里埃）。

2 方法

將菌種接種在斜面培養基上，其中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門氏菌、短小芽孢桿菌、藤黃微球菌接種在胰酪大豆胨瓊脂培養基斜面上，白色念珠菌和黑曲霉接種在沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面上。各菌種的胰酪大豆胨瓊脂培養基斜面除藤黃微球菌26～27℃培養48 h外其余均30～35℃培養18～24 h，白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面20～25℃培養2～3 d，黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面20～25℃培養5～7 d。待菌種充分生長后將培養好的新鮮菌種貼上標簽，用牛皮紙包好，置于4～6℃的冰箱保存。定期檢查菌種情況并記錄，考察期限6個月。

標準菌種經確認試驗，每種菌種每代接種5支斜面，每隔一定時間（保藏期內）再轉接至新的斜面上培養，生長后繼續保藏，如此連續不斷至第5代。

3 實驗結果

白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌保存時間均超過6個月。金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌保存時間在3～6個月。乙型副傷寒沙門氏菌和藤黃微球菌保存時間在2～3個月。銅綠假單胞菌保存時間在1～3個月，銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡[4]，因此室溫保存，保存時間與室溫溫度有關差異較大，室溫低于10℃以下，保存時間要短些，最長存活2個月，溫度在10℃以上可保存2～3個月。5代特性基本不變，保存期限基本一致。但斜面培養基在3個月后有不同程度的干燥情況。見表1。

4 討論

4.1 保藏方法的選擇

菌種的保藏在藥品微生物檢驗工作中起著至關重要的作用，由于菌種的特性不同及菌種保藏方法的優缺點各異[7]，每種方法都有各自的適用范圍和優缺點，應根據菌種的生物學特性、自身的設備條件及實驗室工作內容選擇不同的保藏方法，才能保證菌種的純度和活性，達到研究和藥品檢驗的需求。本文僅對斜面保藏法進行討論，一些不適合用本法保藏的菌種和其他的保藏方法需另行試驗。

表1 藥品檢驗常用菌株斜面保藏法的試驗結果

4.2 本試驗的參考意義

本保藏方法操作簡便，便于提取，但需要經常移種培養，且培養過程中微生物和菌種難免與外部環境接觸因此無法排除變異的可能[8]。《中國藥典》2015年版要求菌株的傳代次數不得超過5代，若每月傳種l次，新購的菌種用不了幾次，有的可能還未用就淘汰了。通過本實驗可總結適宜保存期限，以減少傳代次數，降低污染風險，節約成本。

4.3 保障標準菌種質量的重要意義

微生物具有生命活力，每一代生存時間一般很短，易在傳代過程中發生變異甚至死亡[9]。微生物與藥物的生產與檢驗關系較大[10]，科學的標準菌種保藏方法和管理制度是實驗質量的重要保障，對提升實驗室檢驗工作具有重要意義。菌種保藏時，應注意控制好光照、溫度及濕度，否則會引起菌種退化[11]。在實踐過程中通常會同時選擇多種保藏方法，長期保藏方式和短期保藏方式相結合[12]，以確保標準菌種質量。

除本文討論的斜面保藏法外，還有許多不同的保藏方法，每種保藏方法都有各自優缺點，也有各自的適用范圍。在藥品檢驗工作中需制定科學的標準菌種管理制度，并嚴格執行管理制度。理清所需標準菌種，根據實際情況選擇合適保藏方法，以保證菌種質量及使用安全，確保檢驗質量。