不同微生物發酵豆粕的差異化研究

葉耀輝 鐘魯龍 雷松波 王金寶

（福建省寧德市農業科學研究所，福建寧德 355017）

豆粕是現代養殖中使用最普遍的蛋白質原料，同時，豆粕本身含有多種抗營養因子，如胰蛋白酶抑制劑、植酸鹽等[1]，降低了畜禽對飼料的利用效率。利用微生物固態發酵的方法，可以很好地去除豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、植酸、脂肪氧化酶等[2]，選擇合適的微生物組合，也可以提高豆粕粗蛋白、小分子蛋白、多肽等的含量[3,4]，提高豆粕的營養價值。發酵豆粕一般直接在飼料中添加使用，可提高畜禽生長性能[5,6]，降低水產飼料中魚粉使用量等[7]。發酵所用微生物菌株和發酵后干燥工藝對發酵豆粕營養價值影響很大，特別是發酵后的干燥工段大大降低了發酵豆粕的風味和適口性，且會損失部分益生菌和益生物質。近年來，隨著微生物與固態發酵技術的普及，一些規?；B殖場開始在養殖現場直接進行豆粕固態簡易發酵，以最大程度保留發酵豆粕的酸香風味和益生物質，主要在幼齡動物和種豬飼料中添加使用。由于養殖場技術力量有限，所選菌種一般是網購的復合菌劑，發酵條件也比較簡陋，一般是將豆粕直接裝在桶或者袋子中簡易發酵7～15 d后直接使用，對最終發酵后的豆粕營養組分變化不清楚，導致現場制作的發酵豆粕質量層次不齊，甚至存在霉菌超標的問題，反而對動物有害。本研究選擇了用于豆粕發酵的幾種常用益生菌，分別對豆粕進行發酵處理，研究不同微生物在豆粕發酵過程中產生的一系列微生物和生化指標變化的差異，評估不同發酵條件下可能存在的潛在風險，為養殖場現場發酵提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌購于中國工業微生物菌種保藏管理中心（編號：CICC6075）；釀酒酵母購于安琪酵母股份有限公司；枯草芽孢桿菌購于福建省新閩科生物科技開發有限公司。豆粕購于泉州福海糧油工業有限公司；硫酸銨為分析純級，其他試劑均為工業級。

1.2 發酵液制備

嗜酸乳桿菌制備：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、無水乙酸鈉0.5%、檸檬酸鈉0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸銨0.02%、吐溫0.1%、水1 000 mL，pH值調至6.2～6.6之間，發酵48 h左右停止發酵，將發酵液用蒸餾水調制到菌數為109CFU/mL數量級，備用。

枯草芽孢桿菌制備：將菌粉加蒸餾水調制到菌濃度為109CFU/mL數量級，備用。

釀酒酵母制備：將安琪酵母加蒸餾水調節菌濃度到109CFU/mL數量級，備用。

1.3 基礎物料配制及接種發酵

基礎物料配制與接種：豆粕與水按2∶1比例，枯草芽孢桿菌菌液、嗜酸乳桿菌發酵液、釀酒酵母菌液分別按豆粕重量的10%進行接種。分別在20℃、37℃進行厭氧固態發酵，在第1 d（D1）、第3 d（D3）、第7 d（D7）、第15 d（D15）取樣進行分析，測定接種微生物活菌總數、霉菌總數以及小分子蛋白等生化指標。

1.4 小分子蛋白含量測定

取1 g發酵豆粕溶于50 mL蒸餾水中，調pH值至4.5后進行沉淀，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用Folin-酚法測定蛋白含量[8]。

1.5 垂直板狀十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）

參照Laemmli方法[9]，分離膠質量濃度為125 g/L，濃縮膠質量濃度為44 g/L，電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍染色。豆粕蛋白抽提液用非還原電泳處理液進行處理。

2 結果與討論

2.1 不同接種菌株發酵過程微生物指標變化情況

根據發酵實際條件，豆粕不經任何處理，與水按比例混合后，分別接種不同益生菌，厭氧發酵，在不同時間取樣測定相應的微生物指標。

由表1可知，10%接種量接種不同益生菌，不同的溫度條件下，益生菌生長情況差異很大。20℃時，3種菌株的生長均不明顯，1周后，菌株數量普遍下降，說明溫度較低時，豆粕發酵程度很低，達不到發酵的目的。在37℃條件下，無論芽孢類、乳酸菌類還是酵母類，均生長迅速，尤其以芽孢桿菌萌發生長最快，持續較長時間時活性菌體數仍然很高。接種乳酸菌和酵母菌1周后，有效活性菌數明顯減少。若希望豆粕在發酵中能夠提供有效的益生微生物，則發酵溫度和發酵時間都應該控制在合適范圍內。從表觀性狀看，芽孢桿菌類發酵豆粕顏色偏紅，氣味一般；乳酸菌發酵豆粕有酸香味，味道最佳；酵母菌發酵豆粕則有酒香味，時間越長，酒味越濃，不利于動物采食。

表1 接種微生物菌數變化情況

簡易發酵豆粕外觀看基本沒有霉菌，但仍然有霉菌感染的風險，在上述條件下，霉菌總數測定結果如表2。

表2 霉菌總數變化情況

接種益生菌7 d和15 d時，表觀觀察未發現霉變現象。表2取樣測定結果顯示，1周后，接種芽孢桿菌和酵母菌豆粕中霉菌的數量均有增加，尤其是在37℃條件下，霉菌含量明顯上升。15 d時，接種枯草芽孢桿菌的豆粕霉菌總數已接近霉菌的限量標準。說明在簡易發酵操作實踐中，雖然發酵豆粕外觀看不出太大的差異性，但豆粕內部已經有不同數量的霉菌，隨著發酵時間延長，必然會造成發酵豆粕霉菌毒素含量的增加，對養殖動物有一定的負面作用。從微生物指標看，養殖場現場發酵豆粕時必須嚴格控制發酵溫度和發酵時間，尤其在夏季高溫時發酵時間應控制在1周之內。

2.2 不同接種菌株發酵過程生化指標變化情況

從生產實際來看，對豆粕進行固態發酵主要是希望解決豆粕抗原的問題。豆粕中的主要抗營養因子是抗原蛋白，利用微生物對豆粕進行發酵處理，可以降解豆粕中的7S和11S球蛋白[10]，生成具有益生功能的活性小分子物質。不同微生物對豆粕固態發酵后的小分子含量差異很大，結果見表3。

表3 小分子蛋白的差異

由表3可知，芽孢類微生物固態發酵豆粕后產生的小分子蛋白最多，可達8%以上，其次是乳桿菌類發酵豆粕，最次是釀酒酵母。20℃時，從小分子蛋白含量變化情況看，豆粕發酵程度非常低，遠遠低于37℃條件下的發酵水平。從時間上看，在第3 d后，小分子蛋白的含量雖略有上升，但基本上變化不大，顯示前3 d的豆粕發酵至關重要，此段時間，菌株處于最佳的活力狀態，且在分子水平對豆粕的發酵已基本完成。

2.3 不同接種菌株發酵豆粕蛋白SDS-PAGE比較分析

不同微生物發酵豆粕7天后，分別取樣抽提蛋白，經非還原電泳處理液處理后，進行SDS-PAGE分析，如圖1所示。

圖1 不同微生物發酵豆粕蛋白電泳圖

從圖1可以明顯看出，37℃條件下，芽孢桿菌發酵處理后的豆粕大分子蛋白條帶明顯變淺，大部分被發酵處理成低于20 KDa分子量的小分子蛋白，其次是乳酸菌和酵母菌。而在20℃條件下，3種微生物發酵豆粕對大分子蛋白的酵解程度均比較低。相關研究表明，豆粕中大分子蛋白質含量與小腸絨毛高度隱窩深度呈負相關[11]，這也是發酵豆粕降低大分子蛋白含量后有利于改善幼畜腸道平衡的原因。

本研究數據顯示，用不同種類的微生物對豆粕進行固態發酵處理，均可以不同程度地降低豆粕主要抗原因子7S和11S球蛋白的水平，相應地提高發酵豆粕的小分子物質含量，從而使發酵豆粕應用于仔豬時，可以降低腹瀉率，提高消化酶活性，促進仔豬腸道發育，提高斷奶仔豬生長性能[12]。應用于肉雞和肉鴨則可以提高增重，改善料重比，并降低盲腸大腸桿菌數量，增加乳酸菌數量，改善腸道微環境[13,14]。乳酸菌和酵母菌類微生物可以明顯提高發酵豆粕的香味和適口性，經常作為復配菌種，應用于多菌種發酵豆粕的研究中[15]。

3 結論

發酵豆粕應用效果的差異關鍵在于發酵微生物的選擇。在養殖場簡易發酵時，應根據生產實際需要，選擇合適的微生物菌株或者菌株組合。芽孢類微生物發酵有助于提高小分子蛋白的含量，乳酸菌類微生物則有助于提高豆粕適口性。發酵時應注意溫度與時間的控制，夏季發酵時間應不超過1周，冬季發酵時間適當延長到2周或以上。養殖場應配置簡易的微生物測定工具，隨時監控豆粕發酵過程的微生物變化，防止潛在的微生物安全風險。不同微生物對豆粕的酵解程度不同，發酵豆粕的利用價值差異很大。工業化制備發酵豆粕時，一般采用復合菌種進行好氧或厭氧發酵，在降低豆粕抗營養因子、提高豆粕功能性多肽含量等方面均有很好的效果。