通過電激轉化法選育耐高溫型阿魏側耳菌種

李學斌，高 蕾，關美芝，李 曉

1.烏魯木齊高鑫博淵生物科技有限公司，烏魯木齊 830031 2.烏魯木齊市第十八小學，烏魯木齊 830006 3.烏魯木齊市公安局天山分局，烏魯木齊 830002

阿魏側耳（Pleurotus ferulae）因野生寄生或腐生在中藥阿魏（Ferula sinkianensis）肥大的根莖部，而得俗名阿魏菇[1]。在我國主要分布在新疆。阿魏菇具有很高的食用價值和藥用價值，子實體分化溫度在0 ～15℃，生長溫度6 ～18℃，新疆每年夏季6 月中旬到8 月底，由于氣溫較高，阿魏菇生長停滯。

電激法是利用高壓電脈沖作用，在原生質體膜上“電激孔”（Electroporation），形成可逆的瞬間通道，促進外源DNA 的攝取。自1979 年Zimmerann發明該法以來，經過多年的研究和改進，已廣泛應用于動物、植物的遺傳轉化研究[2]。1991年，Royer JC等首先采用電激法把編碼二氫乳清酸脫酶基因URA1導入同源的楊樹菇營養缺陷型突變菌株中，獲得正常表達的楊樹菇[3]，接著雙孢蘑菇、糙皮側耳等也用該法進行遺傳轉化，獲得轉化子[4，5，6，7]。

采用電激轉化法，將未帶標記的平菇（伏夏200）糙皮側耳總基因組DNA 通過電機轉化導入阿魏菇原生質體，采用臨界溫度篩選轉化子，獲得了生長速度快、不需低溫刺激仍能正常出菇的高溫型阿魏菇新品種。本方法沒有化學物質對原生質體的傷害，操作簡單方便，遺傳轉化效率較高。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

糙皮側耳(P.ostreatus）伏夏200 由新疆農業科學院提供。菌蓋直徑4～9 cm，菌蓋邊緣較圓整，出菇溫度為0～32℃，轉潮快，產量高，生物學轉化率100%。

受體：新疆阿魏側耳（K8，實驗編號：NB）原生質體。

阿魏側耳（P.ferulae）K8 為新疆的主栽品種，子實體叢生，側耳狀(直徑 6～13 cm，厚1～6 cm)，白色，菌絲生長適宜溫度為20～26 色，出菇（子實體生長）溫度8～16 菇，轉化率26%，由新疆農業科學院提供。

1.2 培養基及試劑

菌絲生長培養基: 20 g葡萄糖，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，18 g瓊脂。

PDA液體培養基

原生質體再生培養基：250 g 土豆，10 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，205.4 g 蔗糖（0.6 mol/L ），去離子水1 L。

復蘇培養基：稱取蔗糖，加去離子水至終濃度為0.6 mol/L。

栽培料：62.79%棉籽殼、18%玉米粉、10%麩皮、6%油渣、1%糖、1%石膏粉、1%石灰粉、0.2%阿魏根粉、0.01%磷酸二氫鉀。

穩滲劑：CPW+9%甘露醇。

離析酶5%，纖維素酶10%，蝸牛酶10%均購自上海生工。

1.3 菌絲培養

阿魏側耳、糙皮側耳接種到PDA 平板中[8]，在20 ℃靜置培養5d，收集菌體0.1 g備用。

1.4 原生質體制備及純化

阿魏側耳1 塊菌種塊（直徑0.5 cm）接種于裝有50 mL 液體培養基的250 mL 三角瓶中，20 ℃靜置培養5 d。菌絲用四層紗布過濾并用大量無菌水沖洗。取100 mg 置于滅菌的1.5 mL 離心管中，加入1 mL 酶解液（1%纖維素酶和0.5%蝸牛酶），用滅菌的竹簽將菌絲稍稍剝離分開，使其與酶解液充分混勻，置于30 ℃水浴中2.5～3 h，涂片鏡檢，待原生質數量達到105～106個時即成為實驗用原生質體。用裝有無菌紗布的注射器過濾原生質體液，去除殘留菌絲和雜質后，5 000 r/min 離心10 min 以去除酶解液，將原生質體用滲透壓穩定劑（0.6 mol/mL 的蔗糖）洗滌2 次后，懸浮，即得到純化的原生質體[9]。

1.5 糙皮側耳伏夏200總DNA提取

稱取糙皮側耳子實體放入已冷凍的研缽中，加入2%的PVP，倒入一些液氮，研磨材料，然后加入1mL CTAB[含50 μL DTT（1 Mol/L）]混合，再倒入已加入100 μL 氯仿/辛醇的EP 管中，65 ℃水浴30 min，室溫放置15 min 后，再加氯仿/辛醇到1.5 mL，輕輕混勻，13000 rpm離心7 min。取上清液放入干凈EP 管中，加入冰的無水乙醇0.5 mL,-20 ℃靜置，待出現絮狀沉淀時，13 000 rpm 離心7 min，棄上清液。75%酒精/ 0.2 M NaAc 1mL洗滌沉淀2 次，醇揮發后加入無菌水和RNA 酶，溶解，-20 ℃保存。用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA 的純度。用分光光度計對DNA 進行紫外掃描，測260 nm、280 nm的吸收值，計算出DNA的濃度，最后用無菌水將DNA濃度稀釋到1 μg/μL備用[10]。

1.6 電擊轉化

采用ECM 630 電激系統，預置電壓，電激緩沖液為1 mol/L 的山梨醇。電激前將純化的原生質體42 ℃浮浴5 min，再向低溫處理過的2 mL電激杯加入360 μL 的樣品和24 μL 糙皮側耳DNA 進行電激，冰浴靜置 10～15 min 后，，接種在裝有3 mL 復蘇液體培養基的三角瓶中，80 r/min震蕩培養3 d。取600 μL 接種于PDA 平板上，涂布均勻，32 ℃（受體出發菌株菌絲停止生長甚至死亡）下靜置培養，隨時觀察并挑取單菌落。

1.7 再生菌株篩選

將1.6挑取得單菌落和1.4制備的原生質體接種在PDA 平板上，32 ℃下靜置培養5 d。測定生長速度，選擇生長速度明顯高于出發菌株者的再進行出菇復篩。以出發菌株K8 和伏夏200 為對照。培養6～7 d，分別對單菌落進行鏡檢。

1.8 轉化子的驗證

分別選取10個純合耐高溫和10個純合低溫型的菌種DNA，分別等量混合構建耐高溫池和低溫池，用于篩選與耐高溫基因緊密連鎖的分子標記。利用P.ostreatus基因組序列設計一對有多態的STS標記STS-GX1(F:5′-CTCGACCAAAGATTCGCTGG-3′,R: 5′-TGGTGCCATATCAACTGGGT-3′)，STS 標記對1.7篩選出的再生菌株進行驗證。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，來驗證耐高溫的轉化子。

1.9 轉化菌株出菇試驗

以生物轉化率、子實體的商品性狀（色、菇形、菇質）與出發菌株對比，篩選出生物轉化率明顯提高，并且商品性能同于或優于出發菌株者確定為優良菌株。栽培條件：

1.9.1 溫度

菌絲在5～32 在均可生長，以24～26 生為最佳。子實體生長溫度14～26 佳，最適溫度為16～24適。

1.9.2 濕度和水分

菌絲體和子實體的正常生長發育需要大量水分。菌絲生長期培養基質含水量60%～65%，以62.5%為最佳，料水比為1：1.3～1.5，子實體在空氣相對濕度85%～95%時，能夠正常發育生長。

1.9.3 空氣

阿魏側耳菌絲對二氧化碳有較高的耐受性，種植耐高溫型阿魏菇新品種（＜＜農作物品種登記合格證＞＞新農登字［2015］第58 號，品種名稱：高鑫1828），通氣量要大于常規阿魏菇一倍以上，子實體才能正常分化、生長出優質菇。

1.9.4 光照

菌絲體生長無需光線，但原基的分化和子實體的正常生長發育需要一定的散射光刺激。耐高溫型阿魏側耳新品種（高鑫1828）散射光照強度在600～1 200lux子實體才能正常生長發育。

1.9.5 酸堿度

阿魏菇菌絲在酸性過強（pH4 以下）的培養基上生長受到抑制。。在pH 值5～11 范圍內，阿魏菇菌絲均能生長。但最適pH值為6.5～7.5。

2 結果與分析

2.1 轉化效率和驗證

通過大量的電激轉化試驗，規模為1 過大量9～1過大量10個/mL.在32 ℃時，阿魏側耳K8及其原生質體菌絲均不生長甚至死亡，而供體伏夏200 能正常生長，2 株再生菌株能夠生長，電激轉化率為10%。得到生長速度高于出發菌株的再生菌株K2株。

圖1 篩選出的轉化菌株

圖2 未轉化菌株（對照）

為了進一步驗證和確定轉化子與出發菌株在遺傳上的區別，研究利用分子生物學最新技術，分別設計了15對隨機引物，利用RAPD技術，對轉化子進行了隨機引物PCR 擴增，并對其擴增產物進行了電泳分析。結果表明，絕大多數存在營養不親合菌株，其隨機引物PCR 擴增產物存在不同程度的差別。圖3為轉化菌株600-5與出發菌NB的RAPD 電泳圖，由圖可以看出其與出發菌存在多處不同。

圖3 出發菌株NB與轉化菌株RAPD電泳圖

圖4 轉化子菌株生長速度柱狀圖

2.3 轉化子的鑒定

STS 標記產物大小為231 bp，可用于檢測耐高溫的阿魏菇轉化子。研究結果表明3 為假陽性，4～7為轉化子。

圖5 STS-GX1標記對耐高溫轉化子的鑒定

2.4 復篩及轉化子的出菇試驗：

表1 出菇試驗對比

篩選的轉化菌株命名為阿魏菇（高鑫1828）。出菇試驗結果表明：阿魏菇新種質(高鑫1828)在常溫下（大棚室內溫度白天25℃左右，夜間17℃左右）能正常出菇（見圖6）。農藝性狀：子實體單生，白色，馬蹄形，直徑 10～15 cm，菌肉白色，厚 0.3～6 cm，出菇率100%，生物轉化率45%，高產，每個出菇袋兩頭各出1朵子實體，單朵重175～297 g，生長周期短，出菇時間提前30 d，由120 d提前到90 d。

3 結論

原生質體的制備是應用原生質體技術育種的前提。不同種類的食用菌其原生質體制備的最佳條件不盡相同。制備細胞原生質體時，必須有效地除去細胞壁，而影響原生質體制備的因素很多，其中酶種類和濃度、酶解時間、酶解溫度、輕微振蕩等都是影響原生質體釋放的因素，其中酶解液的往往被認為最重要的因素。因此，本研究按照不同比例將幾種酶混合起來，以此來克服單一酶的缺陷性。

食用菌原生質體的獲得，因其幾乎都是單細胞，而被廣泛用于細胞融合、突變、細胞篩選等育種工作。另外，原生質體也是遺傳轉化的廣泛受體之一，在多種植物的基因改造中都被作為接受外源基因的良好受體，進而從原生質體著手進行基因修飾已經成為食用菌育種的有效途徑之一[11]。

電激轉化技術被證明是一種行之有效的食用菌育種新方法。電轉化技術對改良食用真菌的性狀和創造新的高產優質菌株具有明顯的優勢。該方法突出優點是轉化效率高且操作簡便快速，人為去除細胞壁，解除了菌株間物理上、生理上的主要屏障，因而使食用菌遠緣雜交、相同交配型的雜交、及共生菌根菌的馴化栽培成為了可能。

本研究中選用四種穩定滲透液配制酶解液：0.6 M 蔗糖，1 M 山梨醇，0.6 M 甘露醇，CPW+9%甘露醇，再生原生質體分別涂布在再生培養基和PDA培養基上，PDA培養基作為對照，正常情況下，原生質體不能在其上生長。結果顯示，用CPW+9%甘露醇作為穩滲劑制備酶解液，產生的原生質體效果最佳，再生效率最高。電激轉化電壓設400 V，600 V，800 V，1000 V，1200 V，分別進行電激實驗，結果發現在電壓600 V 下，電擊25 μF，在含0.8 mol/L蔗糖的再生培養基上，原生質體再生時間16 d時，再生率可達0.6%。而電壓過低時，基因導入率太低；電壓過高時，又會使原生質體死亡率過高。參考國內外文獻及實驗結果，選擇再生率為0.6%的電壓600 V，電擊25 μF作為電擊的最佳條件。

食用菌遺傳轉化技術既有綜合不同食用菌遺傳信息的重組作用又有剖析基因組基因，轉移外源基因的分析作用，對生產實踐中創造的食用菌新品種和對食用菌遺傳學的基礎研究都有十分重要的意義。

本研究獲得專利證書（專利名稱：電激轉化法選育高溫型阿魏菇的方法，專利號：ZL 2011 1 0398232.3），并且培育出的阿魏菇新種質（高鑫1828）已通過新疆維吾爾自治區非主要農作物品種登記審定，獲得農作物品種登記證書。