0～6月齡不同排便頻率健康嬰兒的腸道菌群構成分析

陳 嚴，高武紅，易烈致，吳 悠，曾云斌（廣東省深圳市南山區婦幼保健院兒童保健科，廣東深圳518000）

嬰兒糞便的次數和性質常反映胃腸道的生理和病理狀態，故檢查糞便極為重要。嬰兒排便狀況與腸道微生態的關系密切，排便次數已成為兒保、兒科門診的常見主訴。本研究調查 0～6月齡健康嬰兒不同排便狀況的腸道菌群分布、多樣性并優勢菌差異，分析排便頻率不同其對應的腸道菌群構成是否也不同，旨為臨床根據排便狀況有針對性地應用不同種類的益生菌調整腸道微生態環境，改善嬰兒排便狀況提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象

方便抽樣法選取兒保科門診體檢的 0～6月齡健康嬰兒，納入標準：⑴年齡＜ 6 月齡；⑵喂養方法為母乳喂養或混合喂養或人工喂養；⑶采樣前2周未服用過微生態制劑及抗生素。排除標準：⑴排除內分泌或代謝性疾病及藥物引起的便秘， 6月齡內有腦癱、甲低等嚴重疾病，父母有便秘史等；⑵排除器質性疾病：先天性巨結腸、肛門狹窄、肛門周圍炎癥、脊柱裂等疾病；⑶嚴重濕疹；⑷新生兒高膽紅素血癥；⑸近 2周大便次數、顏色、性狀明顯改變的兒童。

1.2 方法

1.2.1 問卷調查 發放自行設計的“嬰兒糞便狀況問卷”，內容包括：嬰兒入院前 2周排便狀況(糞便次數/顏色/性狀)、喂養方式、分娩方式、出生史、月齡、體格生長發育指標，母親飲食習慣、排便狀況，家族便秘史等。 25例家長在明白問卷內容后在醫師指導下自填完成。

1.2.2 糞便標本留取及測序 本次實驗共收集糞便標本 25份。新鮮糞便取樣后留取少量行糞便常規檢查，其余部分立即放進－ 20℃冰箱保存，并集中收集到－ 80℃冰箱長期保存。集中送華大基因公司進行 16SRNA腸道菌群測序及物種分類與豐度分析。

1.2.3 對象分組與觀察指標 按不同的排便頻率將25 例 研究對象分為 3 組 。 a組：(1/3～3)次/d，即排便頻率在 3d及以下排便 1次至 1d排便≤ 3次之間；b組：＞ 3次/d； c組：＜ 1 /3次/d，即 4d及以上排便1次。觀察 3組糞便腸道菌群的物種分類與豐度。

2 結果

2.1 問卷調查分析

本次調查的 0～6月齡嬰兒為 2017年 6月－ 2018年4月來深圳市南山區婦幼保健院兒保科體檢的健康嬰兒， 25例嬰兒出生體質量、身長及目前體格發育指標均正常，其中男嬰 14例，女嬰 11例。分娩方式為順產 17例，剖宮產 8例。純母乳喂養的 10例，混合喂養的 12例，人工喂養 3例。居住地全部在城市，帶養人文化程度為大專及以下的 3例(占 12%)，文化程度為本科及以上的 22例(占 88%)。嬰兒父母均無便秘史。

共收集 25份糞便標本，糞便常規均正常。糞便顏色黃色的 19例(占 76%)，綠色的 6例(占 24%)；糞便性狀為不成形便的 16例(占 6 4%)，成形軟便的 9例(占36%)。a 組12例 (占48 %)；b組 6例 (占24 %)；c 組7 例(占28%)。

2.2 糞便腸道菌群分析

2.2.1菌群在門水平的差異物種分析 本組 25份糞便的腸道菌群測序及物種分類與豐度分析結果顯示其菌群的門水平物種上包含 8個菌門，標本在豐度上個體差異顯著的是擬桿菌門和疣微菌門，詳見圖1。

2.2.2菌群在科水平差異物種分析 a組差異物種是厚壁菌門，梭菌綱，梭菌目，毛螺菌科； b組差異物種是放線菌門，放線菌綱，雙岐桿菌目，雙岐桿菌科； c組排差異物種是擬桿菌門，擬桿菌綱，擬桿菌目，卟啉單胞菌科。 3組在科水平差異物種如圖 2、3、4所示。

3 討論

正常排便是嬰幼兒健康的標志之一。嬰兒排便狀況備受關注，已成為家長常見的焦慮因素和兒保、兒科門診的常見主訴。家長對出生數月內的嬰兒排便次數減少或過多、過硬或過稀、排便時哭鬧、綠色大便等很憂慮，并為此頻繁就診于兒保科或兒科門診。為改善嬰兒排便狀況，臨床已應用益生菌治療小兒功能性便秘、腹瀉、抗生素相關性腸炎等，然而部分小兒治療效果不佳。為針對不同排便狀況使用不同種類益生菌，提高益生菌的使用效率，本研究調查了嬰兒不同排便狀況的腸道菌群分布、多樣性并優勢菌，發現了不同排便頻率的腸道菌群構成差異。

圖1 25個糞便標本門水平物種柱狀圖

圖2 a組差異物種毛螺菌科(lachnospiraceae)

圖3 b組差異物種雙岐桿菌科(bifidobacteriaceae)

圖4 c組差異物種卟啉單胞菌科(porphyromonadaceae)

本研究中嬰兒糞便腸道菌群物種組成和豐度分析發現， 0～6月齡健康嬰兒腸道菌群在菌門水平上豐富、多樣，包含 8個菌門，個體差異顯著的是擬桿菌門和疣微菌門。本研究的重要發現是不同排便頻率的腸道菌群分布不同，存在統計學差異，并且初步發現不同排便頻率在科水平的差異物種。嬰兒排便次數在(1/3～3)次/日，屬于正常排便情況，該組與其它組差異物種是毛螺菌科，該科細菌具有水解多種植物多糖、脫乙酰基作用以降解毒素、拮抗艱難梭菌感染等作用[1-3]，屬于益生菌。陳小玉等[4]發現再生障礙性貧血患兒的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正時，其糞便中毛螺菌科水平整體呈上升趨勢；高仁元等[5]研究結腸癌大鼠與正常大鼠糞便菌群結構性變化時發現，腸癌大鼠糞便菌群中毛螺菌科菌群豐度顯著降低。后續研究可以針對排便次數過多或過少的嬰兒應用毛螺菌科益生菌，觀察嬰兒排便狀況改善情況。 b組的差異物種是雙岐桿菌科。雙歧桿菌科是人體腸道內重要的常見共生細菌，該菌屬下的一些菌種被認為是能對機體產生有利影響的益生菌，純母乳喂養嬰兒排便次數常較人工喂養嬰兒多，既往研究指出純母乳喂養嬰兒腸道雙岐桿菌數量比人工喂養嬰兒高，應用雙歧桿菌是否可以改善排便次數過少嬰兒的排便狀況，臨床需進一步試驗，觀察療效。嬰兒排便次數每天小于 1 /3次，也是困擾家長的問題，該組差異物種是卟啉單胞菌科。卟啉單胞菌科是與牙周病相關細菌，陳智濱等[6]研究發現早產低體質量兒母親唾液中牙齦卟啉單胞菌檢出水平較高，于鑫等[7]在進展期腺瘤患者糞便中也發現牙周病相關細菌卟啉單胞菌屬和牙齦卟啉單胞菌顯著上升。從這些研究可以看出卟啉單胞菌科與疾病發生、發展呈正相關，卟啉單胞菌科細菌是否也正是導致嬰兒排便次數過少的主要腸道菌群？其具體的機制和途徑及干預治療的方法仍需更深入的研究和更大樣本的調查加以明確。

腸道微生態環境與人體健康有著奇妙的關聯。嬰兒腸道微生物影響身體代謝、影響腦發育和行為的觀點已被很多科學探索者接受。反之，我們也可能通過某些措施促進腸道微生物群落的健康，從而改善嬰兒健康。以往對于腸道微生態的研究多采用培養或分子生物學技術，對于腸道微生物群的多樣性研究有明顯的局限性，隨著第二代高通量測序技術的出現，以其測序快、準確度高等特點逐漸應用于腸道微生物的研究，這些研究大多在歐美國家完成，中國此方面文獻報道不多，且樣本量少，結果差異性較大，不能全面體現嬰兒腸道微生物區系的定植及演變全過程。本研究通過高通量測序平臺對嬰兒不同排便狀況的糞便微生物群進行 DNA測序，調查不同排便狀況嬰兒糞便微生物定植多樣性和優勢菌，填補排便狀況與腸道菌群分布關系的研究空白，為應用不同益生菌改善不同排便狀況提供理論線索，為今后研究腸道微生物群系變化與遠期疾病的發生風險提供理論依據。臨床上為益生菌的應用開辟新用途：早期干預，預防嬰兒便秘或腹瀉，促進遠期健康。

從腸道微生態學角度，早期益生菌干預可以通過修飾腸道菌群，提高菌群轉化營養物質為活性化合物的能力，常用菌種有雙岐桿菌、乳桿菌、糞鏈球菌、酪酸梭菌、芽孢桿菌和布拉酵母菌。不同種類的益生菌作用機制不完全相同，對不同疾病的臨床效果存在差異[8]。本研究從排便頻率的直觀現象對應出腸道菌群構成的差異，期望能夠根據嬰兒不同排便頻率有針對性的應用不同種類的菌群調整腸道內環境，改善排便狀況，切實解決排便次數過多或過少給小嬰兒家長造成的困擾。本次實驗收集到的標本量稍少，后續要進行更大樣本的研究以證實結果的可靠性。另外，腸道菌群是一個整體，單一應用益生菌的療效需要進一步的臨床實驗確定。本次研究發現不同排便頻率在科水平存在顯著差異的物種，為后面的研究提供了方向和研究重點。