76株甲氧西林與紅霉素耐藥葡萄球菌的耐藥表型及基因型分析

梁有才，范菲楠，蔣利利，林思強，聶署萍，陸學東*（ .廣東醫科大學附屬第二醫院檢驗科，廣東湛江54000； .中山大學附屬第八醫院檢驗醫學部，廣東深圳580； .廣東醫科大學研究生學院，廣東湛江54000）

葡萄球菌包括凝固酶陽性與凝固酶陰性葡萄球菌。凝固酶陽性葡萄球菌主要是金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌主要包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、頭葡萄球菌、人葡萄球菌、木糖葡萄球菌等。葡萄球菌是引起臨床感染的重要致病菌，甲氧西林是臨床治療產青霉素酶葡萄球菌感染的重要抗生素，耐甲氧西林葡萄球菌的出現，特別是對甲氧西林與大環內脂類抗生素同時耐藥葡萄球菌的出現，給臨床治療帶來較大困難。本研究擬通過對中山大學附屬第八醫院 2014－ 2016年分離所得的耐甲氧西林與紅霉素葡萄球菌的耐藥表型及耐藥基因型進行分析，以及總結其臨床感染的科室分布與標本來源情況，為臨床經驗治療提供實驗數據，亦為進一步建立相關菌株耐藥性的分子生物學快速檢測技術提供實驗基礎數據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

76株葡萄球菌由中山大學附屬第八醫院住院或門診患者各類體液標本分離所得，經過VITEKⅡCompact細菌鑒定系統分析，全部同時對苯唑西林與紅霉素耐藥，其中 54株為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，另外 22株為甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin resistance coagulase negative Staphylococcus，MRCNS)，包括 6 株 溶血葡萄球菌、 3株人葡萄球菌人亞種、 7株頭葡萄球菌、 1株木糖葡萄球菌、 5株表皮葡萄球菌。

1.2 儀器與試劑

EasyPure ?Bacteria Genomic DNA kit(北京全式金生物技術有限公司)，PCR Master Mix(2×) (Fermentas公司)， M arker(北京全式金生物技術公司)，VITEK ⅡCompact 全自動微生物鑒定儀(法國梅里埃公司)， P TC-2000梯度 PCR循環儀(美國MJ Reasearch公司)。

1.3 臨床菌株的準備及其耐藥表型的檢測

取患者體液標本進行細菌分離培養，挑取可疑菌落經 V ITEKⅡ Compact系統鑒定與藥敏檢測，篩選同時耐苯唑西林與紅霉素的葡萄球菌，統計相應菌株藥敏結果，同時挑取相應菌落置負 80℃冰箱儲存備用。 V ITEKⅡ Compact定期參加國家與省臨檢中心室間質評與室內質控。

1.4 臨床菌株耐藥基因型的檢測

1.4.1 引物設計與合成 根據葡萄球菌相應耐藥基因序列，利用 P rimer 5.0軟件設計耐藥基因引物，同時設計細菌16srDNA引物，引物合成由上海輝睿生物科技有限公司完成。詳見表1。

表1 引物序列

(接上表)

1.4.2 耐藥基因的 PCR 擴增分析 將待測菌株接種至血瓊脂平板，置 36.5 ℃ CO 2培 養箱培養 16～18 h，挑取數個單菌落至 1mL雙蒸水調成混懸菌液。采用核酸提取試劑盒(EasyPure ?Bacteria Genomic DNA kit)提取核酸模板液。

使用 PCR技術擴增核酸模板靶基因。PCR反應體系為： PCR Mix 12.5 μL，Forward Primer(10 μmol/L)0.1 μL， Reverse Primer(10 μmol/L)0.1 μL ，DNA模板液 2 .5 μL，補水使總體積達 25 μL。反應程序第一步為 94 ℃5min；第二步為94 ℃ 1 min， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min， 40個 循環；第三步為72℃ 10min。 PCR產物經1 .5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統計學處理

MRSA與MRCNS的耐藥及其所含耐藥基因的比較采用 SPSS 19.0軟件進行卡方檢驗、校正卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病區分布情況

MRSA檢出前三的科室為 ICU、神經科、呼吸科，占比分別為： 37.0%(20/54)、 35.2%(19/54)、11.1%(5/54)，其余科室占比 16.7%(9/54)，包括腎內科、脊柱骨科、心內科各 2株以及甲乳外科、內分泌科、消化科各 1株。MRCNS檢出最多科室為 ICU，占比45.5%(10/22)，其余科室合計占比 54.5%(12/22)，包括呼吸科、腫瘤科、康復科各 2株，以及神經科、泌尿科、產科、新生兒、風濕免疫科各1株。

2.2 標本來源情況

MRSA絕大多數來源于痰，占 87.0%(47/54)；其余來源于尿、靜脈血、膿液、尿道分泌物，分別占5.6%(3/54)、3.7%(2/54)、1.9%(1/54)、1.9%(1/54)。MRCNS主要來源于患者無菌部位標本，其中靜脈血占59.1%(13/22)、尿 18.2%(4/22)、腦脊液 9 .1%(2/22)、腹透液 4 .5%(1/22)、靜脈導管 4 .5%(1/22)，其余為痰，占 4 .5%(1/22)。從痰、靜脈血篩查出的MRSA或MRCNS數量差異存在統計學意義(P<0.01)。

2.3 耐藥表型檢測結果

兩類菌株除了對紅霉素與苯唑西林同時耐藥外，MRSA對 6種抗菌藥物(氨芐青霉素、克林霉素、環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、四環素)的耐藥率均在 50%以上，其中對氨芐青霉素與克林霉素的耐藥率達 100%；對 8種藥物(莫西沙星、利福平、復方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、萬古霉素、替加環素)的耐藥率均在 50%以下，其中對 5種藥物(利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、萬古霉素、替加環素)的耐藥率為0。MRCNS對 4種抗菌藥物(氨芐青霉素、克林霉素、環丙沙星、左氧氟沙星)的耐藥率均超過 50%，其中對氨芐青霉素的耐藥率亦為 100%；對 10種藥物(慶大霉素、四環素、莫西沙星、利福平、復方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、萬古霉素、替加環素)的耐藥率均在 50%以下，但僅對萬古霉素耐藥率為 0。詳見表 2。

2.4 耐藥基因型檢測結果

MRSA與MRCN均 篩出mecA基因，以及至少一種大環內酯類耐藥基因(ermA、ermB、ermC、Sat4、msrA) 。MRSA排名前三的耐藥基因組合為mecA+ermA+ermC、mecA+ermB+Sat4、mecA+ermC，占比分別為 17%、 14%、 8 %，其余基因組合共占 6 1%。耐藥基因組合最多含有 5種基因，含 3種以上基因的組合占比為 8 1.5%(100.0% －3 .7%－ 14.8%)。MRCN排名前三的耐藥基因組合為：mecA+ermC、mecA+MsrA、mecA+ermA與mecA+ermC+MsrA，占比分別為： 22.7%、 22.7%、 13.6%、 13.6%；其余基因組合共占 27.4%；MRCNS耐藥基因組合最多含有 4種基因(mecA+ermC+Sat4+MsrA)，占比 4 .5%；含 3種以上基因的組合占比為 41.0%(100.0%－ 13.6% - 22.7%－22.7%)。見表3 。 各基因PCR 擴 增的電泳條帶見圖1 。

表2 菌株耐藥表型檢測結果

3 討論

從臨床科室感染分布看，MRSA主要來源于ICU、 神經科和呼吸科，而MRCNS在 ICU檢 出最多，占比高達 45.5%。可見， ICU是中山大學附屬第八醫院該兩類細菌來源的重要科室。諸多文獻認為，免疫力低下、侵入性醫療措施以及廣譜抗生素的使用是導致MRSA感染的高危因素，而 ICU患者恰好切合該因素[1-6]。由于在 ICU的檢出率較高，本研究提示導致MRCNS感染的高危因素與MRSA類似。

從標本來源看，MRSA主 要來源于痰液，MRCNS主要來源于無菌標本，靜脈血占比較大，兩者從痰與靜脈血的檢出率存在統計學差異。 這主要是因為，在臨床微生物實驗室的實際工作中，從痰液分離出優勢生長的MRSA考慮為致病菌而進行鑒定藥敏；而凝固酶陰性葡萄球菌往往被認為是人體黏膜定植菌，其導致肺部感染風險較低[2-5]。由痰標本分離的MRCNS容易被考慮為非致病菌，從而忽略對其進行進一步的鑒定藥敏或者醫療干預。本研究發現MRCNS從 ICU患者血液標本篩查所得占比較高，可能是因為抽血不佳導致污染定值菌群所致，但若能排除污染因素，則提示MRCNS是由于缺少醫療干預措施導致其血源感染的可能性大，應引起注意。

表3 耐藥基因的PCR檢測結果

圖1 PCR擴增靶基因電泳圖

從耐藥表型分析， 14種臨床常用抗生素中，兩類菌株除了對苯唑西林與紅霉素同時耐藥外(本研究中菌株的篩選標準)，MRSA與MRCNS對各種抗菌藥物的耐藥情況有所不同。一方面，MRSA耐藥率達50%以上的抗菌藥物較MRCNS多，耐藥率在 50%以下的抗菌藥物較MRCNS少，且 M RSA耐藥率達100%的抗菌藥物較MRCNS多；但另一方面，MRSA耐藥率為 0的抗菌藥物亦較MRCNS多。因此，實際上是否說明MRSA對臨床抗生素耐藥性比MRCNS更嚴重，尚待進一步的研究。

從耐藥基因型分析，同一菌株MRSA與MRCNS均可同時篩出甲氧西林耐藥基因與大環內酯類耐藥基因，說明兩類菌株的耐藥性均基于特定的耐藥機制。但MRSA能篩出比MRCNS更多耐藥基因，且篩出 3種以上基因組合的MRSA占比較MRCNS高，提示MRSA的耐藥機制比MRCNS更加復雜。

綜上所述，MRSA與MRCNS感染的高危因素類似，臨床應注意對免疫力低下患者的接觸隔離以及相關抗生素的合理使用，特別是MRCNS的條件致病性可能是導致血源感染的重要途徑，應高度重視。MRSA與MRCNS的抗生素耐藥情況大體一致但又有個別不同：兩類細菌對氨芐青霉素、克林霉素、環丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率均在 50%以上，對莫西沙星、利福平、復方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、萬古霉素、替加環素耐藥率均在 50%以下；值得指出的是，MRSA對慶大霉素、四環素的耐藥率在 50%以上，MRCNS反之。MRSA與MRCNS均可篩出甲氧西林耐藥基因與大環內酯類耐藥基因，說明利用基因篩查能確認相應菌株對相關抗生素的耐藥性，該研究為進一步利用分子生物學技術為手段，建立快速鑒定菌株耐藥性的方法提供了實驗基礎[7-8]。此外，同一菌株MRSA比MRCNS篩出更多的耐藥基因，篩出 3種以上耐藥基因占比更高，提示耐藥機制更為復雜，應注意抗生素的合理使用。