一株高效苯酚降解菌的篩選及降解性能考查

石瑞文 哈妮 郭楠 張曉琴 關海濱

摘 要 從煉油廠廢水排放口附近污染較為嚴重的土壤樣本中馴化篩選、鑒定苯酚降解菌株，對該菌株在不同苯酚濃度下進行降酚能力的考查。方法 采用以苯酚為唯一碳源、逐量分批的方法馴化、篩選苯酚降解菌株，利用形態學、生理生化反應以及16SrDNA序列鑒定菌株。結果 篩選到一株苯酚降解菌株，鑒定為不動桿菌屬，該菌株48h內對苯酚（1.5g·L-1）的降解率為82.86%。結論 經過馴化篩選和苯酚降解條件的優化，所得苯酚降解菌株具有良好的苯酚降解能力。

關鍵詞 苯酚降解菌 馴化篩選 降解性能

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A

工業化程度的提高使許多工廠大量排放含酚廢水，水中生物的生存和飲用水水源質量等都遭到極大的威脅。

生物法處理含酚廢水具有能耗少、處理效率高、二次污染少等優點。本研究旨在從酚類污染物排放企業所排出的污泥以及被污染的土壤中篩選獲得高效降酚菌群并分離出單一高效降酚菌株，通過對獲得的高效降酚菌株降酚能力的考查、培養基的優化以及鑒定分類，為相關研究提供實驗參考，為工業化處理含酚廢水提供理論依據。

1材料與方法

1.1培養基

（1）唯一碳源培養基：苯酚終濃度分別為0.1g·L-1至1.5g·L-1。

（2）富集培養基：蛋白胨10. 0g·L-1，牛肉浸膏5. 0 g·L-1，NaCl 5. 0 g·L-1，pH7. 0。

（3）富集（分離）固體培養基：苯酚濃度若干、瓊脂濃度為15.0 g·L-1。

1.2實驗方法

1.2.1苯酚降解菌的分離與純化

選取煉油廠廢水排放口附近污染較為嚴重的土壤，溶于無菌蒸餾水中，將其稀釋液涂布于含有苯酚的分離固體培養基梯度平板上。32℃培養36～48h。選取生長在苯酚濃度較高區域并且形態較好的細菌單菌落，于分離固體斜面培養基上擴大培養。

1.2.2苯酚降解菌株的馴化、篩選

將1.2.1所得菌株接入含0.1 g·L-1苯酚的唯一碳源培養基中，32 ℃，pH7.0，150 r/ min 振蕩培養24 h。重復上述培養過程，直至苯酚濃度達到1.5 g·L-1，選取單位時間內降酚率較大的菌株。

1.2.3苯酚降解菌生長量的測定及苯酚濃度的測定

以OD 600nm代表該菌體的生長狀況，采用4-氨基安替吡林法測定苯酚濃度。

1.2.4苯酚降解率的計算

降解率（%） = （1-反應后苯酚濃度/ 苯酚起始濃度） ？100 %

1.2.5苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查

選取不同培養溫度（T）、三角瓶裝量（V）、搖床轉速（v）等因素對培養條件進行單一條件及正交優化。

1.2.6不同苯酚濃度下苯酚降解菌株的降酚能力考查

將處在對數生長期的菌液按5%的接種量接入含苯酚濃度分別為0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1的唯一碳源培養基中，32℃，pH7.0，150r·min-1培養，計算48h內苯酚降解率。

1.2.7苯酚降解菌的鑒定

（1）傳統方法鑒定。通過降酚菌株的個體和菌落特征、生長狀況、革蘭氏染色以及生理生化反應初步鑒定該菌株。

（2）分子鑒定。設計細菌的16SrDNA序列通用引物，擴增其16SrDNA序列，引物序列F1：5′CCCAAGCTTGGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，F2：5′CGGAATTCCGTACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，擴增條件94℃、3min；（94℃、30sec；52℃、30sec；72℃、1 min）30個循環；72℃、5min；4℃保存，測序。

2結果

2.1苯酚降解菌株的分離篩選

經過分離篩選，共挑取30株耐酚菌株，選取其中降酚率較高且遺傳穩定的一株菌（HSG-18072313）作后續研究。

2.2苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查

菌株HSG-18072313最佳降解苯酚的培養溫度（T）、三角瓶裝量（V）、搖床轉速（v）分別為：30℃、50ml/250ml、150r·min-1。

2.3不同苯酚濃度下菌株HSG-18072313的降酚能力

48h內對苯酚濃度為0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1降解率分別為93.28%、92.34%、89.56%、82.86%。

2.4菌株的鑒定

菌株HSG-18072313顯微形態為桿狀，菌落圓形，表面及邊緣光滑整齊，顏色為淺黃色，革蘭氏染色呈陰性。

利用blast軟件將菌株HSG-18072313的16SrDNA序列與Genebank中已報道的16SrDNA序列進行同源性比較，結果表明菌株HSG-18072313的16SrDNA序列與在Genebank登記的多株不動桿菌屬的菌株具有高度的同源性（≥97%）。

結合顯微和菌落鑒定結果、生理生化反應、分子鑒定，將HSG-18072313歸屬為不動桿菌屬。

（通訊作者：關海濱）

基金項目：內蒙古醫科大學2018年度大學生創新創業訓練計劃校級項目（2018101320041）；內蒙古醫科大學2017年度本科教學工程和教育教學改革項目（NYJXGG2017022）。

作者簡介：石瑞文（1981-），男，碩士研究生，講師；通訊作者：關海濱（1982-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：生物技術藥物。