miR`-375對結直腸癌細胞侵襲遷移影響及其與Notch2通路蛋白的關系

[摘要]目的探討microRNA`-375（miR`-375）對結直腸癌（CRC）細胞侵襲遷移的影響及該影響與Notch2通路蛋白的關系。方法將表達miR`-375的慢病毒轉染入人CRC細胞HCT`-116細胞中作為實驗組，將空載慢病毒轉染入HCT`-116細胞中作為陰性對照組（NC組），未轉染HCT`-116細胞作為空白組，采用實時熒光定量PCR（qRT`-PCR）方法檢驗轉染效率，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，Western Blot方法檢測Notch2通路蛋白的相對表達。再將Notch2小干擾RNA（siRNA）轉染入HCT`-116細胞中作為Notch2`-siRNA組，將陰性對照轉染入HCT`-116細胞中作為Notch2陰性對照組，未轉染HCT`-116細胞作為空白組，采用Western Blot方法檢測3組細胞Notch2蛋白表達量，采用Transwell小室實驗進一步驗證Notch2表達的改變對CRC細胞侵襲遷移的影響。結果CRC細胞中miR`-375表達明顯低于人正常結直腸黏膜細胞（t=33.00，Plt;0.05）。使HCT`-116細胞中的miR`-375過表達后，與NC組和空白組相比，細胞的侵襲、遷移能力均下降（F=223.40～894.16，Plt;0.05），且Notch2通路蛋白相對表達量下降（F=100.63，Plt;0.05）。將Notch2下調后，與Notch2陰性對照組和空白組相比，Notch2`-siRNA組細胞的侵襲遷移能力下降（F=144.31～197.54，Plt;0.05）。結論上調miR`-375表達可以抑制CRC細胞的侵襲遷移，這一作用可以通過調控Notch2來實現。

[關鍵詞]結直腸腫瘤;微RNAs`-375;Notch2;腫瘤轉移

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of microRNA`-375 （miR`-375） on the invasion and migration of colorectal cancer （CRC） and its association with Notch2 pathway protein. MethodsHuman CRC HCT`-116 cells transfected with the lentivirus with miR`-375 expression were included as experimental group， HCT`-116 cells transfected with the empty lentivirus were included as negative control group （NC group）， and untransfected HCT`-116 cells were included as blank group. Quantitative real`-time PCR was used to measure transfection efficiency， Transwell chamber was used to evaluate cell invasion and migration， and Western Blot was used to measure the relative expression of Notch2 pathway protein. HCT`-116 cells transfected with Notch2 small interfering RNA （siRNA） were included as Notch2`-siRNA group， HCT`-116 cells transfected with negative control were included as Notch2 negative control group， and untransfected HCT`-116 cells were included as blank group. Western Blot was used to measure the protein expression of Notch2， and Transwell chamber was used to verify the effect of the change in Notch2 expression on the invasion and migration of CRC. ResultsCRC cells had significantly lower expression of miR`-375 than normal human colorectal mucosal cells （t=33.00，Plt;0.05）. Compared with the NC group and the blank group， the HCT`-116 cells with miR`-375 overexpression had significant reductions in the invasion and migration of cells （F=223.40-894.16，Plt;0.05） and the relative expression of Notch2 pathway protein （F=100.63，Plt;0.05）. Compared with the Notch2 negative control group and the blank group， the Notch2`-siRNA group with downregulated Notch2 had significant reductions in the invasion and migration of cells （F=144.31-197.54，Plt;0.05）. ConclusionUpregulation of miR`-375 expression can inhibit the invasion and migration of CRC cells， which can be achieved by the regulation of Notch2.

[KEY WORDS] colorectal neoplasms; microRNAs`-375; notch2; neoplasm metastasis

結直腸癌（CRC）是第三大常見的癌癥，也是男性和女性癌癥死亡的第三大原因，已知有多種致瘤途徑均可導致CRC的發生[1]。侵襲和遷移是CRC致死的主要原因，但其機制仍未明確[2`-3]。因此，從分子水平研究CRC侵襲遷移的影響因素意義深遠。微小RNA（miRNA）是一種小型非編碼RNA分子，它參與基因沉默和癌癥惡化的調節[4]，同時也可以影響細胞功能包括惡性轉化、血管生成、細胞生長以及炎癥反應等[5]。其中，miR`-375是一種多功能的miRNA，參與胰島發育、葡萄糖體內平衡、黏膜免疫、肺表面活性劑分泌以及腫瘤發生等。最近的研究結果顯示，miR`-375在多種癌癥中表達量顯著降低，并可通過抑制星形細胞上調基因`-1（AEG`-1）、Yes相關蛋白1（YAP1）、胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）和3`-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶`-1（PDK1）等幾個重要的致癌基因來發揮抑癌作用[6]。Notch信號通路是一種進化上保守的細胞信號通路，它可以對癌癥發生、癌癥干細胞生物學特性和腫瘤血管生成產生影響，其在腫瘤學領域作為潛在治療靶點具有重要地位[7]。Notch信號通路由Notch受體、DSL蛋白配體（Delta/Serrate/lag2）和細胞內效應分子組成，Notch受體又可以分為Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，其中Notch2受體與多種癌癥密切相關。而Notch2的表達與CRC密切相關，并可能在腫瘤抑制中發揮作用。本實驗研究miR`-375、Notch2及CRC間的關系，分析其可能的分子機制，為CRC的分子靶向治療提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

人類CRC細胞株HCT`-116及人正常結直腸黏膜細胞（FHC）購自吉凱基因化學技術有限公司;胎牛血清、RPMI`-1640培養基、胰蛋白酶及青霉素`-鏈霉素雙抗購自北京索萊寶科技有限公司;miR`-375慢病毒（HIV）及空載病毒（HIV）購自吉凱基因化學技術有限公司;聚凝胺購自北京索萊寶科技有限公司;Li`-pofectamineTM2000、Trizol試劑購買于美國Invitrogen公司;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq RR420A試劑盒購自大連Takara公司;基質膠購自美國BD公司;Transwell小室購自美國康寧公司;Notch2小干擾RNA（siRNA）及陰性對照購自Santa Cruz公司;Notch2一抗購自CST公司;β`-actin一抗、二抗購自Absin公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養用含體積分數為0.10胎牛血清、10 g/L青霉素`-鏈霉素雙抗的RPMI`-1640培養液培養細胞。在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養，每24 h更換1次培養液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。當細胞融合度達80%左右時傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR（qRT`-PCR）方法檢測miR`-375表達量收集細胞，根據TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，應用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）將其反轉錄成cDNA，應用SYBR Premix Ex Taq RR420A進行qRT`-PCR （bio`-rad CFX96）檢測細胞中miR`-375的表達。反應條件：95 ℃，30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環;60 ℃、15 s。實驗重復3次。實驗所用引物來自上海生物技術工程有限公司。其序列見表1。

1.2.3miRNA轉染及表達檢測將生長狀態良好HCT`-116細胞接種于96孔板，每孔5×104個，培養24 h。實驗分為實驗組、陰性對照（NC）組和空白組，每組設3個復孔。將聚凝胺按1∶2 000稀釋，每孔10 μL，與miR`-375慢病毒共同轉染HCT`-116細胞作為實驗組，與空載慢病毒共同轉染HCT`-116細胞中作為NC組，未轉染HCT`-116細胞作為空白組。感染復數（MOI）值為25。加入培養液后將96孔板放于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養10 h，移除培養液，每孔加入100 μL新的培養液，培養箱中繼續培育24 h，應用qRT`-PCR方法檢測3組細胞miR`-375的表達量。結果取3個復孔平均值，實驗重復3次。

1.2.4siRNA轉染及表達檢測將生長狀態良好的HCT`-116細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養24 h。實驗分為Notch2`-siRNA組、Notch2陰性對照組和空白組。將Notch2`-siRNA和陰性對照分別與Li`-pofectamineTM2000按照20∶1的比例混合后加入到兩組HCT`-116細胞中，每孔105 μL混合物，分別作為Notch2`-siRNA組和Notch2陰性對照組，未轉染細胞為空白組。將3組細胞加入含體積分數0.10胎牛血清的RPMI`-1640培養液2 mL，放于37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養6 h，移除培養液，每孔加入2 mL新培養液。48 h后收集細胞，應用Western Blot方法驗證Notch2蛋白是否下調成功。實驗重復3次。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力向24孔板中加500 μL含體積分數0.15血清的RPMI`-1640培養液，將Transwell小室放于孔中，取生長狀態良好的細胞接種于Transwell小室的上室，每孔5×104個，加200 μL無血清的RPMI`-1640培養液于上室;將24孔板置培養箱培育24 h后取出，以PBS清洗小室，用棉簽輕輕拭去上室細胞，甲醇固定15 min，結晶紫染色15 min，PBS溶液清洗3次，取出拍照，對照片中細胞計數，進行統計學分析。侵襲實驗：將基質膠用RPMI`-1640培養液稀釋10倍后，每個小室內加入100 μL，放入培養箱4 h后取出，將小室中液體輕輕吸出，其余步驟同遷移實驗。48 h后觀察并拍照，計數細胞，進行統計學分析。實驗重復3次。

1.2.6Western Blot方法檢測Notch2蛋白相對表達量提取細胞蛋白，使用BCA法檢測蛋白濃度，用Western Blot方法分別檢測實驗組、NC組、空白組細胞以及Notch2`-siRNA組、Notch2陰性對照組、空白組細胞的Notch2蛋白表達。將50 μg蛋白在SDS`-PAGE凝膠上電泳并分離，將分離后的蛋白分子轉至PVDF膜上，于低速搖床上用含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h。加入Notch2一抗（1∶1 000），4 ℃過夜孵育。加入二抗（1∶3 000）孵育2 h。用ECL發光液在顯影儀中進行目的蛋白顯影并保存圖片。分析條帶灰度，以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值表示Notch2蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.3統計學分析

應用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料結果以±s形式表示，多組數據間比較采用方差分析，兩組數據間比較應用t檢驗。以Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1miR`-375對各指標檢測結果的影響

2.1.1HCT`-116細胞、FHC細胞miR`-375表達比較HCT116細胞、FHC細胞miR`-375相對表達量比較差異有顯著性（t=33.02，Plt;0.05）。見圖1。

2.1.2各組miR`-375表達比較實驗組HCT`-116細胞miR`-375表達量較NC組明顯增加，差異有統計學意義（F=8 413.05，Plt;0.05）;NC組與空白對照組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表1。

2.1.3miR`-375對細胞遷移數目影響實驗組遷移細胞數顯著少于空白組和NC組，差異有統計學意義（F=223.40，Plt;0.05），空白組與NC組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表1。

2.1.4miR`-375對細胞侵襲數目影響實驗組侵襲細胞數顯著少于空白組和NC組，差異有統計學意義（F=894.16，Plt;0.05）; 空白組與NC組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表1。

2.2下調Notch2對各指標檢測結果影響

2.2.1各組Notch2相對表達量比較空白組和NC組細胞Notch2蛋白相對表達量高于實驗組，差異有統計學意義（F=100.63，Plt;0.05）;空白組與NC組Notch2蛋白相對表達量比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表1、圖2。

2.2.2Notch2對細胞遷移和侵襲影響Western Blot結果顯示，空白組（A組）和Notch2`-陰性對照組（B組）的Notch 2蛋白相對表達量高于Notch2`-siRNA組（C組），差異有統計學意義（F=805.35，Plt;0.05），空白組與Notch2`-陰性對照組比較差異

214青島大學學報（醫學版）55卷

無顯著性（Pgt;0.05）。見表2、圖3。Transwell遷移實驗顯示，Notch2`-siRNA組遷移細胞數顯著少于空白組和Notch2`-陰性對照組，差異有統計學意義（F=197.54，Plt;0.05），空白組與Notch2`-陰性對照組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表2。Transwell侵襲實驗顯示，Notch2`-siRNA組侵襲細胞數顯著少于空白組和Notch2`-陰性對照組，差異有統計學意義（F=144.31，Plt;0.05）;空白組與Notch2`-陰性對照組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表2。

3討論

miRNA是一組內源性的、進化保守的非編碼小分子RNA，它在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。miRNA是重要的調控RNA，在各種生物過程和人類疾病中控制基因表達，可以通過翻譯抑制或mRNA降解來調節轉錄后的基因表達[8]。近年來，miRNA在癌癥中的作用得到了廣泛的研究，多項研究表明，miRNA可以通過調節細胞增殖、細胞黏附、凋亡和血管生成而發揮致癌或抑癌作用[9]。有研究進一步表明，miRNA作為癌癥研究中的診斷及預后標志物有很大意義。在多種癌癥中miR`-375表達紊亂，miR`-375在胃癌、膠質瘤、CRC、胰腺癌、肝癌、鱗癌中呈低表達，而在甲狀腺髓樣癌、乳癌和前列腺癌中高表達[10]。另有研究表明，miR`-375作為一種腫瘤抑制因子，可以抑制某些類型癌癥的細胞生長和腫瘤進展[11]。與正常人類結直腸組織相比，miR`-375在人類CRC細胞系和組織中大多數呈低表達[12]，這表明miR`-375的變化可能與CRC的發生發展有關。以往的研究證明，miR`-375可以通過調節KLF4來抑制CRC的增殖[13]，也可以通過調節pi3k/akt信號通路抑制CRC細胞的生長[12]。還有研究發現，hsa`-miR`-375和hsa`-miR`-133a`-3p可能為CRC的新標記物[14];miR`-375作為抑癌基因起著重要作用，如能夠增加卵巢癌細胞的凋亡[15]。但在前列腺癌中miR`-375卻促進了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[16]，提示miR`-375在腫瘤細胞中的作用具有組織細胞特異性。本文研究miR`-375對CRC細胞侵襲與遷移能力是否有影響，研究結果表明miR`-375過表達對于CRC細胞的侵襲轉移能力具有抑制作用，這與miR`-375為抑癌基因的研究結果相一致。

然而，在CRC中miR`-375的具體作用機制仍不清楚。為了闡明miR`-375調節CRC侵襲遷移的潛在分子機制，本文研究了miR`-375的可能通路。Notch信號通路是一個高度保守的細胞信號系統，在細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能中均發揮著重要作用[17]。Notch信號軸由Notch受體、DSL蛋白配體和細胞內效應分子組成，Notch受體又分為Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，其中Notch2參與多種癌癥的發生，促進腫瘤生長，降低化療敏感性[19]。目前，Notch信號通路被認為在多種癌癥中發揮作用，是調節正常腸黏膜細胞譜系分化的必要條件[19]。以往研究顯示，CRC中Notch信號調節異常，且該異常貫穿整個腫瘤發生過程[20]。Notch信號參與CRC的發生和發展，且高表達Notch信號與癌癥的進展和轉移相關[21]。使用基因分析軟件篩選miR`-375的可能性直接靶點，發現Notch與Wnt通路中的NOTCH2、RBPJ等基因包含了與miR`-375直接結合的位點[22]。有研究顯示，拮抗Notch2/Notch3能有效地治療包括乳癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌在內的多種上皮腫瘤[23]，下調Notch2還可以抑制胃癌的增殖、侵襲和轉移，也可以抑制腫瘤干細胞的性狀和膀胱癌的進展[24]。在以往CRC基因組突變譜的研究中還發現了融合基因PHKB`-NOTCH2[25]。因此，本文選取Notch2作為研究對象。已有研究顯示，Notch2表達與CRC密切相關，并可能在腫瘤抑制中發揮作用[26]。本文實驗結果顯示，miR`-375過表達能夠抑制Notch2通路蛋白的表達，進而抑制CRC細胞的侵襲和遷移;將Notch2用siRNA下調后，CRC的侵襲遷移能力下降，二者的作用是一致的。

以上結果表明，miR`-375是調節CRC侵襲轉移的靶點，它的作用可以通過調控Notch2實現。本文盡管明確了CRC細胞中miR`-375與Notch2之間的靶向關系，但miRNA在腫瘤發生發展中發揮作用的機制十分復雜，Notch通路亦復雜多變，還需要更深入地研究，才能為臨床上腫瘤的治療提供更多的可能性治療靶點。

[參考文獻]

[1]PERICLEOUS M， MANDAIR D， CAPLIN M E. Diet and supplements and their impact on colorectal cancer[J]."Journal of Gastrointestinal Oncology， 2013，4（4）：409`-423.

[2]ZHOU Jiaojiao， ZHENG Shu， SUN Lifeng， et al. MicroRNA regulation network in colorectal cancer metastasis[J]."World Journal of Biological Chemistry， 2014，5（3）：301`-307.

[3]DUAN J， CHEN L， GAO H， et al. GALNT6 suppresses progression of colorectal cancer[J]."American Journal of Cancer Research， 2018，8（12）：2419`-2435.

[4]ZHENG Keyan， LIU Weicheng， LIU Ye， et al. MicroRNA`-133a suppresses colorectal cancer cell invasion by targeting Fascin1[J]."Oncology Letters， 2015，9（2）：869`-874.

[5]YIU A J， YIU C Y. Biomarkers in colorectal cancer[J]."Anticancer Research， 2016，36（3）：1093`-1102.

[6]YAN Junwei， LIN Jusheng， HE Xingxing. The emerging role of miR`-375 in cancer[J]."International Journal of Cancer， 2014，135（5）：1011`-1018.

[7]ESPINOZA I， MIELE L. Notch inhibitors for cancer treatment[J]."Pharmacology amp; Therapeutics， 2013，139（2）：95`-110.

[8]WANG Xinglong， JIA Yanqing， WANG Xiangwei， et al. MiR`-375 has contrasting effects on Newcastle disease virus growth depending on the target gene[J]."International Journal of Biological Sciences， 2019，15（1）：44`-57.

[9]SIRIWARDHANA C， KHADKA V S， CHEN J J， et al. Development of a miRNA`-seq based prognostic signature in lung adenocarcinoma[J]."BMC Cancer， 2019，19（1）：34.

[10]KUMAR S， XIE H， SCICLUNA P， et al. MiR`-375 Regulation of LDHB plays distinct roles in polyomavirus`-positive and negative merkel cell carcinoma[J]."Cancers， 2018，10（11）：90`-102

[11]ZHANG Hailong， LIU Tao， YI Sha， et al. Targeting MYCN IRES in MYCN`-amplified neuroblastoma with miR`-375 inhi`-bits tumor growth and sensitizes tumor cells to radiation[J]."Molecular Oncology， 2015，9（7）：1301`-1311.

[12]WANG Yihui， TANG Qingchao， LI Mingqi， et al. Micro`-RNA`-375 inhibits colorectal cancer growth by targeting PIK3CA[J]."Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014，444（2）：199`-204.

[13]MAO Q， QUAN T， LUO B， et al. MiR`-375 targets KLF4 and impacts the proliferation of colorectal carcinoma[J]."Tumour Biology， 2016，37（1）：463`-471.

[14]WEBER D， AMAR L， GODDE D， et al. Extensive screening of microRNA populations identifies hsa`-miR`-375 and hsa`-miR`-133a`-3p as selective markers for human rectal and colon cancer[J]."Oncotarget， 2018，9（43）：27256`-27267.

[15]SHAO Xiaowen， MEI Wenjie， WENG Wenhao， et al. MiR`-375 enhances ruthenium`-derived compound Rawq01 induced cell death in human ovarian cancer[J]."International Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2013，6（6）：1095`-1102.

[16]PICKL J M， TICHY D， KURYSHEV V Y， et al. Ago`-RIP`-Seq identifies Polycomb repressive complex Ⅰ member CBX7 as a major target of miR`-375 in prostate cancer progression[J]."Oncotarget， 2016，7（37）：59589`-59603.

[17]NIKOLIC N， JAKOVLJEVIC A， CARKIC J， et al. Notch signaling pathway in apical periodontitis： correlation with bone resorption regulators and proinflammatory cytokines[J]."Journal of Endodontics， 2019，45（2）：123`-128.

[18]HUA Chunbo， SONG Shengbo， MA Huili， et al. MiR`-1`-5p is down`-regulated in gallbladder carcinoma and suppresses cell proliferation， migration and invasion by targeting Notch2[J]."Pathology Research and Practice， 2019，215（1）：200`-208.

[19]GUILMEAU S. Notch signaling and intestinal cancer[J]."Advances in experimental medicine and biology， 2012，727：272`-288.

[20]VINSON K E， GEORGE D C， FENDER A W， et al. The notch pathway in colorectal cancer[J]."International Journal of Cancer， 2016，138（8）：1835`-1842.

[21]LIAN Haifeng， JIA Xingfang， SHI Ning， et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4[J]."Cancer Management and Research， 2018，10：6129`-6141.

[22]ABRAHAM K J， ZHANG X， VIDAL R， et al. Roles for miR`-375 in neuroendocrine differentiation and tumor suppression via notch pathway suppression in merkel cell carcinoma[J]."The American Journal of Pathology， 2016，186（4）：1025`-1035.

[23]YEN W C， FISCHER M M， AXELROD F， et al. Targeting notch signaling with a notch2/notch3 antagonist （tarextumab） inhibits tumor growth and decreases tumor`-initiating cell frequency[J]."Clinical Cancer Research， 2015，21（9）：2084`-2095.

[24]TENG J， AI X， JIA Z， et al. Long non`-coding RNA ARAP1`-AS1 promotes the progression of bladder cancer by regulating miR`-4735`-3p/NOTCH2 axis[J]."Cancer Biology amp; Therapy， 2018， 2018：1`-10.

[25]TENG H， GAO R， QIN N， et al. Identification of recurrent and novel mutations by wholegenome sequencing of colorectal tumors from the Han population in Shanghai，eastern China[J]."Molecular Medicine Reports， 2018，18（6）：5361`-5370.

[26]CHU Dake， ZHENG Jianyong， WANG Weizhong， et al. Notch2 expression is decreased in colorectal cancer and related to tumor differentiation status[J]."Annals of Surgical Oncology， 2009，16（12）：3259`-3266.