返魂草藥材提取方法考察與特征圖譜建立

王春馳，周婷婷，紀圣君，朱迪夫，姜瑞芝，高其品,2*

（1.吉林省吉測檢測技術有限公司，長春 130117；2.長春中醫藥大學，長春 130117；3.吉林益民堂制藥有限公司，吉林 四平 136001）

返魂草（Senecio cannabifolius Less.）為菊科千里光屬多年生草本植物，以其為原料的制劑如返魂草顆粒（肺寧顆粒）具有清熱祛痰，鎮咳平喘之功效。市場已有多家企業生產該成藥，臨床廣泛用于治療肺內感染，慢性支氣管炎，喘息性支氣管炎，急性呼吸道感染等[1]。已有大量文獻報道，返魂草的主要活性成分為有機酸和黃酮類，兩類成分均顯示出多種生物活性[2-7]。目前，對返魂草藥材指紋圖譜的研究的也有報道[8]，但提取方法暫無水煎-醇超聲法，因此，本研究對返魂草提取方法進行考察，以獲得成分信息反映更加完整的HPLC譜圖，同時，也對色譜條件進行優化，結果顯示Agilet Zorbax SB-C18色譜柱（4. 6 mm×250 mm，5-Micron）分離效果最好，乙腈-0.1%三氟乙酸溶劑系統為流動相的色譜峰分布、分離度較好，檢測波長為330 nm色譜峰最多，響應值較高。最后研究建立了返魂草HPLC對照特征圖譜并確定8個特征峰的相對保留時間，為該藥材的質量控制研究提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國塞多利斯公司）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5A-ws離心機（長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 實驗試劑 甲醇、乙腈（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；三氟乙酸（長春三邦醫藥科技有限公司）；綠原酸對照品（110753-201716）、金絲桃苷對照品（11521-201708）、異槲皮苷（11809-201403）（中國食品藥品檢定研究院）；新綠原酸（B21396）、隱綠原酸（B21587）、異綠原酸A（B21539）、異綠原酸B（B21540）、異綠原酸C（B21541）（上海源葉生物科技有限公司）。共收集了不同產地的返魂草樣品4份，由吉林益民堂制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 提取方法考察

2.1.1 水煎法 取藥材粉末（過四號篩）2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定質量，煎煮1 h，適時搖晃補水，放冷，再稱定質量，以水補足減失的質量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 醇超聲法 取相同藥材粉末置錐形瓶中，精密加入質量分數為70%的甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用質量分數為70%的甲醇補足減失質量，搖勻，離心，精密量取上清液2.5 mL置10 mL量瓶中，用質量分數為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 水煎-醇超聲法 取相同藥材粉末至錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，煎煮1 h，適時搖晃補水，放冷，稱定重量，以水補足減失的重量，搖勻，精密加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補足減失重量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.4 考察結果 圖1為水煎法、醇超聲法和水煎-醇超聲法提取返魂草藥材的HPLC圖譜，對比可發現，通過水煎法提取返魂草藥材其HPLC圖譜中4、5、6、7、8號峰較小，醇超聲法提取的返魂草藥材其HPLC圖譜中1、3、6號峰較小，而通過水煎-醇超聲法提取的樣品其HPLC圖譜中可以看出8個成分的轉移率均有較大的提高，使整個圖譜呈現指紋性，更具有信息完整性。故選擇水煎-醇超聲法作為返魂草藥材提取方法從而建立返魂草藥材HPLC特征圖譜。

圖1 三種方法提取返魂草藥材的HPLC圖譜

2.2 色譜條件 Agilet Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5-Micron），流動相為乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）溶劑系統，梯度洗脫（0～25 min，8%～18% A，25～ 50 min，18% ～ 22 % A，50～ 55 min，22%～8% A，55～60 min，8%～8% A），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長330 nm。進樣量10 μL。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號篩）2.0 g，精密稱定，至錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，煎煮1 h，適時搖晃補水，放冷，再稱定重量，以水補足減失的重量，搖勻，精密加甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理1 h（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補足減失質量，搖勻，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3.2 參照物溶液的制備 取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.3.3 混合對照品溶液制備 分別取對照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C適量，分別加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，得混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液，分別于供試品溶液制備后第0、4、8、12、16 h進樣，以2號峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間和峰面積的RSD范圍分別為0. 41%～0. 52%，0.08%～1.60%。表明供試品溶液在制備后16 h內穩定。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取相同供試品溶液，連續進樣6次，以2號峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間和峰面積的RSD范圍分別為0.04%～0.10%，0.10%～0.30%表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取相同樣品粉末6份，按2.3.1中方法處理，得供試品溶液，分別進樣，記錄特征圖譜，以2號峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間和峰面積的RSD范圍分別為0. 21%～0. 48%，0.18%～1.15%表明該方法的重復性良好。

2.5 返魂草藥材的HPLC特征圖譜的建立 按2.2方法記錄4個不同產地返魂草藥材0～60 min HPLC特征圖譜。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版本）生成對照特征圖譜，建立返魂草HPLC對照特征圖譜，通過與對照品圖譜比對（見圖2），指認1號峰為新綠原酸、2號峰為綠原酸、3號峰為隱綠原酸、4號峰為金絲桃苷、5號峰為異槲皮苷、6號峰為異綠原酸B、7號峰為異綠原酸A 、8號峰為異綠原酸C（見圖3）。

2.6 特征峰相對保留時間的確定 返魂草HPLC特征圖譜有8個特征峰，其中2號峰為綠原酸，峰面積相對較大，重復性好，作為參照峰（S），依據2015年版《中國藥典》關于中藥特征圖譜的規定，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，在規定值的5%。將相對保留時間的平均值作為規定值，分別為：0.67（峰1）、1.00（S峰）、1.08（峰3）、2.11（峰4）、2.18（峰5）、2.52（峰6）、2.69（峰7）、3.07（峰8）8個特征峰相對保留時間，見表1。

圖2 對照品圖譜

圖3 返魂草藥材的HPLC對照特征圖譜

3 討論

目前返魂草相關研究報道中多采用醇超聲法和索氏提取法[9-13]作為返魂草藥材提取方法，本研究首次選用水煎-醇超聲法提取返魂草藥材并建立了HPLC特征圖譜，該提取方法簡便且靈敏度高，特征性成分信息完整，可用來全面評價和監測返魂草藥材的質量。本次研究采集了4個產地的返魂草樣品來考察提取方法進而建立HPLC特征圖譜并確定特征峰相對保留時間，并不能充分的體現返魂草化學成分的特性，還有待采集更多樣品進行分析。