復方五鳳草液對結核性潰瘍家兔創面愈合的影響

余 洋，黃子慧 ，錢佳燕，朱思洵

（1.南京中醫藥大學，南京 210046；2.南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院，南京 210014）

結核性潰瘍[1]約占肺外結核半數以上，而且其病程纏綿，極難愈合，或愈后容易復發[2]，臨床治療難度頗大，給患者的工作生活帶來很大的困擾。多年臨床發現，我院內協定方復方五鳳草液應用于結核性潰瘍的治療，療效確切可靠[3-4]。因此本研究旨在通過建立結核性潰瘍動物模型，觀察復方五鳳草液在干預家兔結核性潰瘍創面過程中TB-PCR的變化，探討該外用藥物促進潰瘍愈合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只SPF級雌性SD新西蘭兔，體質量約2 000～2 500 g，平均（2162±80.9）g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物許可證號：SCXK（蘇）2012～0008。適應性飼養1周后將新西蘭兔隨機分為：1）模型組（結核性潰瘍）；2）異煙肼組；3）親水性纖維含銀輔料組；4）復方五鳳草液高劑量組；5）復方五鳳草液中劑量組；6）復方五鳳草液低劑量組；每組6只。

1.2 藥物制備 復方五鳳草液處方：五鳳草2000 g，白及240 g，貓爪草400 g等。制備工藝：將以上諸藥，加水浸過藥面，煎煮3次，1 h/次，合并煎液，濾過，濾液濃縮分裝，生藥含量為2.64 g/mL（此為高劑量組）。將該藥液分別稀釋2倍、5倍，制成中、低劑量組。以上藥液由南京市中西醫結合醫院中藥制劑室提供，4℃冰箱保存。

1.3 家兔結核性潰瘍模型制備 將凍存于- 80 ℃BCG菌種（蘭州大學結核病研究中心暨病原生物學研究所提供）取出，接種于改良羅氏培養基，在37 ℃，5%CO2的條件下復蘇培養。待菌落形成（約3周）后，刮取菌落研磨，至對數生長期時收集菌體，取一定量制備好的菌液進行梯度稀釋。待菌落形成（約4周）后，進行菌落計數，確定菌液濃度。菌液與50%丙三醇以3:2比例混勻，于- 70 ℃保存。新西蘭兔在常規飼養1周后，腹腔注射鹽酸氯胺酮（150 mg /kg體質量）麻醉，在造模區（兩側腹背部）剃毛，接種100 μL。6周后以相同劑量再次皮下注射免疫，大概免疫后4周，可見類上皮增生為主的結核肉芽腫，并可見朗罕氏細胞（見圖1，圖2）。

1.4 給藥 造模成功后每2天予新西蘭兔潰瘍面換藥，用無菌棉片在藥液中浸濕后敷于潰瘍面后用紗布覆蓋并固定。按組分別予以復方五鳳草液高中低劑量、異煙肼注射液、親水性纖維含銀輔料，模型組予以普通油紗外敷。

圖1 結核性肉芽腫病理表現

1.5 觀察指標

1.5.1 創面愈合率 創面愈合率=（原始創面面積—時相點未愈合面積）/原始創面面積×100%。在用藥前及用藥后第3、7、14、21天分別在透明紙上按新西蘭兔創緣描畫，通過掃描儀輸入微型計算機，采用軟件Osiris版本4. 19計算像素的方法進行創面面積計算。以第一次測量的創面面積為潰瘍初始面積，以各時相點取材時測量的面積為時相點創面面積。

1.5.2 創面愈合時間 觀察并記錄所有新西蘭兔從創面用藥起到創面完全上皮化所需時間。

1.5.3 FQ-PCR定量檢測 用藥后第3、7、14、21天行局部麻醉，切取創面肉芽組織，應用TB-PCR 熒光檢測試劑盒（上海復星長征醫學科學有限公司） 進行TB-PCR 檢測，嚴格按照說明書進行操作：借助熒光信號檢測PCR 產物，PCR 每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，確定CT 值，根據CT 值確定起始DNA 拷貝數，進行DNA 定量分析，對治療過程進行結核桿菌量化監控。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件單一指標分析與多指標綜合評分法結合分析實驗結果。多指標綜合評分法評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出各項指標不同的權重。 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組創面愈合率比較 見表1。

表1 各組創面愈合率比較（±s ，n=6） %

表1 各組創面愈合率比較（±s ，n=6） %

注：與模型組、陽性藥物組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 第3天 第7天 第14天 第21天模型組 9.76±4.35 13.2±6.37 18.1±5.37 27.3±7.21高劑量組 10.1±3.97 36.6±9.24## 61.8±7.04 80.3±9.16##△△中劑量組 9.44±3.28 29.4±8.96## 43.2±6.15 58.9±4.37##△低劑量組 10.2±4.19 26.9±8.53# 36.3±4.39 46.8±6.23#異煙肼組 10.6±4.75 14.3±10.1 21.4±6.21 29.9±4.58親水性纖維含銀輔料組 11.0±3.91 25.9±11.4# 28.6±9.04 37.3±8.16#

2.2 各組創面愈合時間 見表2。

表2 各組創面愈合時間（n=6） d

2.3 各組TB-PCR定量檢測（CT值） 見表3。

表3 各組TB-PCR定量檢測（CT值）（n=6）

3 討論

結核性潰瘍常見于淋巴結核、骨結核等病變中后期破潰后形成的創面，還見于處于結核病活動期或有結核感染史的患者身體某部位的長期不愈之創面[5-6]，及接種卡介苗區域反復破潰不愈[7]。研究[8]報道糖尿病患者合并TB 頻發，其臨床治療難度較大，嚴重影響患者工作生活。

復方五鳳草液為老中醫經驗方，以五鳳草、白芨、貓爪草為主藥等制作而成。其中五鳳草[9]（澤漆），性味辛苦，涼，有毒。有行水消痰、殺蟲解毒功能。其藥理實驗表明：能抑制結核桿菌的生長。白及[10]，有生肌、斂瘡、止血之功能。現代藥理研究，白及對結核桿菌有抑制作用。貓爪草[11]性味甘辛、溫，主治瘰疬。諸藥合用，共奏提膿去腐，活血生肌之效。且液態制劑，與創面“濕性愈合”之理念相吻合。

實驗結果表明，復方五鳳草液能有效提高創面率，縮短創面愈合時間，同時我們對創面組織中結核桿菌數量進行動態監測，隨著創面漸趨愈合，TB-PCR的數量也同步逐漸減少，可見復方五鳳草液通過減少創面TB-PCR的數量有效促進創面修復。