miRNA表達譜在腎纖維化中的差異表達及抗纖靈的干預研究

蔣宇峰，朱堯焓，陳 剛，何立群*

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021；2.上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203）

慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）是目前臨床上常見疾患，據文獻報道[1]，全球成人慢性腎臟病的男女發病率分別高達10.4%和11.8%，可見積極防治CKD有重要現實意義。慢性腎臟病到終末期腎衰主要病理基礎就是腎纖維化，其確切的發病機制目前仍不十分明確。MicroRNA（miRNA）是內源性非編碼短RNA，它通過在轉錄之前抑制靶mRNA 達到抑制基因表達的能力。在腎臟疾患中miRNA 與腎臟病變、穩態及生理功能等緊密相連[2]。在腎纖維化研究中TGF-β/Smad 信號通路是最經典主要的通路，據文獻研究[3]提示 miRNA 在 TGF-β介導的纖維化中起重要作用。本研究試通過阿霉素腎病大鼠這個平臺，來探討miRNA在抗腎纖維化中的作用，提供中藥復方抗纖靈的治療靶點和機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠48只，體質量（200±20）g，清潔級，上海中醫藥大學動物房提供，實驗大鼠自由飲水進食。

1.2 實驗藥物 抗纖靈方組成：丹參15 g，制大黃15 g，黃芪15 g，牛膝15 g，桃仁15 g，淫羊藿15 g組成。藥物購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房，按比例稱取，水煎濃縮，冰箱保存。科素亞：0.1 g/片，默沙東公司提供，灌胃前用蒸餾水配制成混懸液。

2 方法

2.1 動物造模及分組方法 48只大鼠適應性喂養1周后，其中8只為假手術對照組，僅以打開腹腔，切除右腎，注射同等量生理鹽水對照為主。余下采用右腎摘除加重復注射阿霉素的腎衰竭腎纖維化動物模型。常規手術右腎摘除術后一周，予阿霉素5 mg/kg尾靜脈注射，術后4周重復注射阿霉素3 mg/kg。術后6周內采血，然后根據肌酐水平隨機分成5組：模型組，科素亞組，抗纖靈組低劑量組，中劑量組，高劑量組，每組各8只大鼠。

2.2 給藥方法 假手術對照組，模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，抗纖靈組低，中，高劑量組分別灌服抗纖靈藥液2 mL，低，中，高劑量大鼠分別分別以60 kg體質量成人單位劑量的10倍，20倍，30倍，給藥劑量相當于 15 g/（kg·d）、30 g/（kg·d）、45 g/（kg·d），對照組科素亞2 mL，劑量33.3 mg/（kg·d），灌胃1次/d，共56 d。

2.3 收集腎組織標本和血、尿標本 6組大鼠連續給藥56 d后，在處死前1 d收集24 h尿量，統計尿蛋白定量。處死大鼠時，通過采血腹主動脈3～5 mL后，摘除左腎，清洗后，放入液氮保存，便于后序相關指標檢測。

2.4 檢測指標 大鼠腎組織TGF-β，Smad3的表達水平采用熒光定量PCR法。取大鼠腎臟組織，以Trizol法抽提RNA。逆轉錄操作生成cDNA，進行熒光定量操作，循環參數如下：95℃，5 min預變性；95℃，5 s變性，60℃退火30 s，40次循環。所得CT值以2-△△Ct計算mRNA的相對表達量。

Trizol試劑盒提取大鼠腎臟RNA，根據SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina說明書進行文庫制備，將樣品送至蘇州金唯志生物科技有限公司進行高通量測序。

2.5 統計學方法 統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行，計量資料數據用均數±標準差（±s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統計學意義。利用FastQC來對測序數據質量進行評估，比對大鼠miRNA數據庫（Rnor_mir/rno.gff3），對miRNA進行表達定量。對差異表達的基因（DEGs）數據進行聚類分析，生成主成分分析圖（PCA）和熱圖（HCA）。

Keywords:Kangxianling Decoction；renalfibrosis；adriamycin nephropathy；profiles of miRNA expression

3 結果

3.1 熒光定量PCR檢測結果 見圖1。

圖1 Smad3和TGF-β1結果比較

由圖1可見，與假手術組相比，模型組及治療組腎臟組織中TGF-β1、Smad3基因表達均有明顯升高，差異具有顯著意義（P＜0.05）。與模型組相比，科素亞治療組和抗纖靈治療組腎臟中TGF-β1、Smad3表達量降低，其中科素亞治療組具有明顯統計學差異（P＜0.05），抗纖靈隨著用藥劑量的增加，差異開始顯現（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.001）。

3.2 主成分分析/聚類分析 見圖2。

圖2 主成分分析

在PC1層面，假手術組（NC）和模型組（OC）相距最遠，表示NC組和OC組樣本的生物學差異較大，其他組（治療組）則介于NC和OC的中間位置，高抗纖靈組（HK）與假手術組（NC）最接近。

3.3 HCA聚類匹配 見圖3。

圖3 HCA聚類分析

HCA聚類分析如圖3所示，從聚類關系上，OC組獨立于其他分組聚到一起，說明腎纖維化的建模取得了成功，其他治療組在一定程度上都起到了腎臟的修復的作用；其中HK組整體上與NC組跟接近，KS組次之，MK和LK的聚類更遠。

3.4 miRNA差異表達分析 見圖4。

圖4 與模型組差異表達的miRNA數目比較

我們將假手術組（NC）和藥物處理組（HK，MK，LK，KS）的miRNA表達譜分別與模型組（OC）進行了比較。采用基因表達倍數變化大于1.5和t檢驗，P＜0.05為標準進行差異表達基因的篩選。并對差異表達基因的數量進行了統計。縱坐標表示差異表達基因數量，數量越多，差異越大。從圖4中可以看出，NC組與OC組的差異最大，其次是高劑量治療組（HK），再次是KS組和MK，LK組與OC組的差異較小。

4 討論

腎纖維化是各種原因引起終末期腎病（ESRD）的的共同病理基礎，早期延緩，具有非常重要的現實意義。目前，尚缺乏有效生物診斷早期標志物和治療手段，TGF-β/Smads是公認促腎纖維化最主要的信號通路[4]，miRNAs 的發現為評估及治療為腎纖維化提供了全新的視角和方向。miRNAs 是一類長度約22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，在生長發育、細胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發生等過程中發揮重要作用。miRNAs在腎臟纖維化發展過程中存在異常表達，提示它可能參與腎臟纖維化的過程并起到重要作用[5]。

腎纖維化中TGF-β1是最重要的促纖維細胞因子[6]，其受體效應蛋白Smad在腎纖維化中也起到重要作用，Smad3 作為通路限制性分子之一，被TGF-β1激活，調節靶蛋白的表達[7]。通過本實驗發現模型組TGF-β1、Smad3基因表達均有升高，經治療后比較，TGF-β1、Smad3表達量降低，有明顯統計學差異，其中抗纖靈隨著用藥劑量的增加，差異開始顯現顯著，提示治療效果的不斷好轉，推測通過抑制TGF-β1表達，下調Smad3，從而調節靶蛋白（如ECM）的表達，達到減輕 ECM 聚積，延緩腎硬化的的發生。

本研究通過miRNA表達譜主成分分析發現，表達譜相似的樣本會被聚集在一起。NC組（空白）和OC組（模型組）相距最遠，兩者的生物學差異較大，其中高纖靈組其表達譜位置較中纖靈組，科素壓組位置與空白組相距位置更為接近，從而提示高纖靈組具有更好的療效。同樣通過HCA聚類匹配分析發現，NC組的聚類與HK（高劑量）組最為接近，說明高劑量的抗纖靈治療更接近空白對照，其對腎臟的修復程度最好，而KS（科素亞組），MK（中劑量組）則效果次之。通過miRNA表達譜差異表達分析， NC組與OC組的差異最大，其次是高劑量治療組（HK），再次是KS組，最后是MK組；MK組與OC組的差異較小，說明高劑量治療組的基因表達譜變化最接近空白對照組變化，提示藥物處理劑量越大，樣本的表達譜越與對照NC組相近，表明隨著劑量增大抗纖維化的效果越好。

抗纖靈方為上海中醫藥大學附屬曙光醫院何立群教授的經驗方，該方以活血化瘀，補腎益氣為治則，與慢性腎衰的中醫病機，正氣虧虛，氣虛血滯，絡脈瘀阻的不謀而合。方中黃芪補氣升陽，仙靈脾溫陽補腎，兩者為君藥；丹參益氣活血，桃仁祛瘀活血，牛膝補腎活血，此三藥為臣；制大黃清熱泄濁活血，為本方佐藥。抗纖靈方以活血為主，兼以扶正泄濁，攻補兼施，使瀉而不傷正，補而不滯邪。該方在臨床和動物實驗研究抗腎纖維化取得較好療效[8-9]。本實驗證實抗纖靈方治療后，無論是在TGF-β1/Smad3 mRNA的表達，還是miRNA表達譜的差異改變，抗纖靈都呈現劑量效應，表明腎臟的纖維化程度改善跟抗纖靈劑量大小有關，同時其中顯現的差異基因有待進一步通過后續試驗篩選和驗證。

綜上所述，抗纖靈方通過益氣活血補腎作用，減少TGF-β1、Smad3基因表達，而起到抗腎纖維化作用，保護腎臟。推測其機理可能通過調節miRNA譜改變，來發揮作用，并且抗纖維化作用與劑量呈依賴關系。