F17大腸桿菌在湖羊羔羊個體脾臟中LncRNA表達譜變化

黃賽男，金澄艷，鮑建軍，王悅，陳煒昊，吳天弋，王利宏，呂曉陽， 高雯，王步忠，朱國強，戴國俊，孫偉，5

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F17大腸桿菌在湖羊羔羊個體脾臟中LncRNA表達譜變化

黃賽男1，金澄艷1，鮑建軍2，王悅1，陳煒昊1，吳天弋1，王利宏1，呂曉陽1， 高雯1，王步忠3，朱國強4，戴國俊1，孫偉1，5

（1揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009；2南京新九州農牧科技有限公司，南京 210000；3江蘇西來原生態農業有限公司，江蘇泰州 225300；4揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；5揚州大學教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇揚州 225009）

【目的】通過篩選對大腸桿菌（）F17菌毛非腹瀉型與腹瀉型的綿羊脾臟中差異表達的lncRNA，來探究lncRNA對綿羊抗腹瀉的作用。【方法】本研究通過對湖羊羔羊口服F17菌株獲得非腹瀉和腹瀉型個體，利用羔羊腸道細菌計數、病理組織切片驗證攻毒成功性；構建非腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟的cDNA文庫，使用Illumina HiSeq 2500平臺進行配對測序；通過Gene Ontology（GO）和KEGG Pathway富集分析對差異表達轉錄本功能描述和細胞通路分析，利用FPKM法估計lncRNA和mRNA轉錄物的表達水平，并用高通量測序技術RNA-seq篩選出非腹瀉和腹瀉個體脾臟中的差異表達lncRNA；然后利用熒光定量PCR技術檢測了非腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟組織中DE lncRNA和DE mRNA的表達水平，來驗證篩選的DE lncRNA在非腹瀉組過程中發揮作用。【結果】羔羊口服F17菌株后，出現非腹瀉和腹瀉兩種表型，腹瀉組羔羊腸道中的細菌數量顯著高于非腹瀉組（＜0.05），同時腹瀉組羔羊空腸黏膜組織出現不同程度的損傷，色澤暗沉，小腸絨毛部分脫落。筆者利用RNA-seq在非腹瀉和腹瀉羔羊脾臟中篩選出34個差異表達的（DE）lncRNA，703個的DE mRNA，隨機選擇一共12個DE lncRNA和DE mRNA，用q-PCR驗證它們在非腹瀉型和腹瀉型羔羊體內的相對表達水平，發現與RNA-seq結果一致。通過Gene Ontology（GO）和KEGG Pathway富集分析，將DE lncRNA與GO 數據庫進行比對的結果表明一共有34條lncRNA被注釋和分類到302個功能亞類中，綿羊蛋白質結合（GO：0005515），細胞核（GO：0005634），poly（A）RNA結合（GO：0044822），細胞質（GO：0005737），組織重塑（GO：0048771），內肽酶活性的調節（GO：0052548）），6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶復合物（GO：0043540），磷脂酰肌醇磷酸化（GO：0046854），果糖-2,6-二磷酸2-磷酸酶活性（GO：0004331），鈣依賴性磷脂酶C活性（GO：0050429）等10 個功能亞類的lncRNA較多，而其余的功能亞類的lncRNA分布較少。將DE lncRNA與KEGG 通路數據庫進行比對的結果表明，一共有34條lncRNA被注釋和歸類到149個KEGG 通路中，綿羊甲狀腺激素信號通路（路徑：ko04919），Spliceosome（路徑：ko03040），白細胞跨內皮遷移（路徑：ko04670），神經營養因子信號通路（路徑：ko04722），溶酶體（路徑：ko04142），MAPK信號通路 - 途徑（路徑： ko04011），鞘脂信號通路（路徑：ko04071），吞噬體（路徑：ko04145），氧化磷酸化（路徑：ko00190）等9 個KEGG 通路的lncRNA較多，而其余的KEGG 通路的lncRNA分布較少。 通過lncRNA-mRNA相互作用網絡分析，發現6個共表達基因：MYO1G、TIMM29、CARM1、ADGRB1、SEPT4、DESI2。【結論】探究了對于腹瀉產生非腹瀉和腹瀉型羔羊脾臟中lncRNA的表達譜，發現了非腹瀉和腹瀉羔羊脾臟中差異表達的lncRNA，有助于找出羔羊如何抵抗腹瀉的發生機制，為羔羊抵抗腹瀉提供科學的依據。

大腸桿菌F17；lncRNA；湖羊羔羊

0 引言

【研究意義】羊大腸桿菌病是規模化羊場最為常見高發的細菌性疾病之一，傳統沿用的抗生素治療方案存在諸多缺陷。檢測影響綿羊大腸桿菌非腹瀉型相關基因的表達情況是分析綿羊抗病分子機制的基礎，從而可以發現與抗大腸桿菌性狀相關的候選基因。【前人研究進展】1966年，Orskov等[1]首先報道了豬源大腸桿菌黏附性抗原K88，后證實黏附性抗原K88是一種依賴于質粒表達的蛋白質抗原[2]，電子顯微鏡下觀察到其形態為暴露在菌體表面的絲狀物。目前已經鑒定出多種動物源產腸毒素大腸桿菌（ETEC）菌毛，包括K88、K99、987P、F17和F41等都是動物源ETEC重要的黏附性毒力因子。lncRNA（Long non-coding RNA）是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。大量的研究表明，lncRNA 與人類各種腫瘤、心血管疾病和代謝疾病的發生具有密切的聯系和調控作用。值得注意的是，近年來越來越多的研究表明，lncRNA在抗病毒等天然免疫反應中也具有重要的調控作用[3-7]，相比于人的lncRNA，羊的lncRNA功能研究較滯后，而且大多集中在分析lncRNA對羊肌肉生長發育、睪丸發育、毛囊發育等性狀的調控作用[8-10]。【本研究切入點】目前，關于綿羊抗病方面研究還不多，少量的研究主要集中在疾病防治方面[11-12]，而綿羊抗病的分子遺傳學基礎研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】利用RNA-seq，對大腸桿菌F17菌毛非腹瀉型與腹瀉型綿羊個體脾臟中差異表達lncRNA進行篩選，并基于順式（cis）機制進行靶基因預測以及功能注釋分析，篩選出關鍵lncRNA。在此基礎上利用qPCR進行驗證。本研究從lncRNA層面上，加深了對綿羊非腹瀉組大腸桿菌F17菌毛的認識，同時有望確定綿羊非腹瀉型大腸桿菌F17菌毛的功能基因，解決中國地方羊品種對大腸桿菌病的抗病育種關鍵問題，為今后制訂抗大腸桿菌病遺傳選育策略奠定基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和樣本采集

試驗用綿羊于2016年12月購自泰州市西來原生態農業有限公司。隨機選擇生長發育良好、日齡體重相近的18只3日齡羔羊，并將羔羊全部隔離飼養。先用10%羔羊奶粉（表1）飼喂，以確保在試驗前適應飲食需要。5日齡時飼喂12.5%羔羊奶粉和大腸桿菌F17菌液（4.6×108CFU/mL），同時保證自由飲水。每天記錄羔羊糞便形態（表2），在有一些羔羊持續腹瀉2 d后，將羔羊分為非腹瀉組和腹瀉組，并對羊進行安樂死。用4%多聚甲醛收集腸道組織。用RNAlater收集每只羔羊的肝臟、脾臟、十二指腸、空腸和回腸，并立即在液氮中冷凍以進行RNA提取。

表1 奶粉成分（每100克奶粉）

表2 糞便形式量[20]

1.2 H.E.染色

用0.9%鹽水洗滌空腸組織，并在室溫下用4%多聚甲醛固定48 h，然后進行組織學分析。接下來，用蘇木精-伊紅染色7 μm切片，并在顯微鏡下觀察空腸上皮形態。

1.3 文庫建設和測序

從每組中的3只綿羊脾臟提取總RNA，并使用NanoDrop 2000超微量分光光度計和Agilent 2100生物分析儀進行質控。用Ribo-Zero TM試劑盒（Epicenter, Madison, WI, USA）除去核糖體RNA。將RNA片段化（平均長度約為200 bp），然后通過逆轉錄合成和純化cDNA。使用Qubit?dsDNA HS測定試劑盒進行PCR擴增和純化后，選擇使用NEBNext?Ultra?RNA文庫制備試劑盒進行文庫構建。在上海歐易生物醫學科技有限公司使用Illumina HiSeq 2500平臺，對文庫進行末端配對測序（測序讀長為150 bp）。

1.4 鑒定lncRNA和mRNA

過濾原始數據以消除低質量讀長，使用映射到參照基因組（Ovis aries v4.0）的干凈讀長進行組裝。用CPC[13]、CNCI[14]、Pfam[15]、PLEK[16]四種編碼潛能分析方法，將來自未知轉錄物中推定的編碼RNA和非編碼RNA候選物進行分類。將最小長度和外顯子數設置為閾值，濾出推定的編碼RNA，長度超過200 nt的兩個外顯子的轉錄物被選為lncRNA候選物。使用cuffcompare歸類不同類型的lncRNA，主要包括intergenic lncRNA（字符為u），intronic lncRNA（字符為i）, anti-sense lncRNA（字符為x），sense- overlapping lncRNA（字符為o）。

1.5 差異表達分析

由于FPKM法[17]同時考慮了測序深度和轉錄本長度對fragments計數的影響，因此使用FPKM值（fragments Per kb per Million reads，是每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目）估計lncRNA和mRNA轉錄物的表達水平。使用DESeq[18]軟件檢測兩組之間DE基因的數量和FPKM值。在利用RNA-seq數據比較分析兩個樣品中同一個轉錄本是否存在差異表達的時候，選取兩個標準：一是FoldChange，就是兩樣品中同一個轉錄本表達水平的變化倍數；二是p-value或FDR（padjust），FDR值的計算方法先要對每個轉錄本計算p-value，再用FDR錯誤控制法對p-value作多重假設檢驗校正。默認篩選差異的條件為＜0.05且| log2（倍數變化）|＞1。

1.6 GO和KEGG通路分析

得到差異表達轉錄本之后，對差異表達轉錄本進行GO富集分析，對其功能進行描述（結合GO注釋結果）。統計每個GO條目中所包括的差異轉錄本個數，并用Fisher's exact test計算每個GO條目中差異轉錄本富集的顯著性（默認篩選差異的條件為＜0.05）。KEGG[19]是有關通路的主要公共數據庫，利用KEGG數據庫對差異轉錄本進行通路分析（結合KEGG注釋結果），并用Fisher's exact test計算每個通路條目中差異轉錄本富集的顯著性（默認篩選差異的條件為＜0.05），通路分析對試驗結果有提示作用，通過差異轉錄本的通路分析，可以找到富集差異轉錄本的通路條目，尋找不同樣品的差異轉錄本可能和哪些細胞通路的改變有關。

1.7 預測DE lncRNA的靶基因

通過計算多個基因之間的Pearson相關系數和值預測DE lncRNA的靶基因。使用|corelation|≥0.7并且≤0.05來過濾轉錄物，選擇與黏附功能相關通路的DE lncRNA，并通過順式和反式作用預測所有DE lncRNA的靶基因。

1.8 驗證DE lncRNA的表達水平

為驗證篩選的DE lncRNA在非腹瀉組過程中發揮作用，用q-PCR檢測了非腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟組織中一共12種DE lncRNA和DE mRNA的表達水平，使用2-ΔΔCt方法將每個RNA的相對定量歸一化為GAPDH，lncRNA的引物見表3。

1.9 統計分析

使用SPSS軟件（版本20.0）分析所有數據，使用單因素方差分析（ANOVA）分析差異轉錄本的相對表達量，并使用Tukey檢驗進行多重比較。＜0.05被認為具有統計學意義。每組包含3個樣品，每個試驗重復3次。

2 結果

2.1 非腹瀉組和腹瀉組腸道細菌數量比較及組織學形態觀察

根據糞便形態[20]，將試驗個體分為非腹瀉組（12、13、14p）與腹瀉組（15、16、17p）。在腹瀉組中，細菌計數在4.7×108至1.9×109之間，但在非腹瀉組中細菌計數下降到了5.1×106至9.0×107。與非腹瀉組相比，腹瀉組羔羊腸道細菌數量明顯較高（＜0.05，表4，圖1），腹瀉組羔羊空腸黏膜組織出現不同程度的損傷，色澤暗沉，細胞死亡、裂解，黏膜下層留下較大間隙，腸絨毛部分脫落，腸道黏膜中豐富的毛細血管都被極大的破壞，難以在切片中找到相應結構（圖2）。

表3 GAPDH，DE lncRNA和mRNA的引物

表4 非腹瀉組與腹瀉羔羊腸道細菌數量對比

圖1 非腹瀉組與腹瀉羔羊腸道細菌數量對比

圖2 非腹瀉組和腹瀉組羔羊空腸組織學形態觀察

2.2 綿羊脾臟RNA測序概述

構建非腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟的cDNA文庫，使用Illumina HiSeq 2500平臺進行測序，分別產生了354 943 820和370 616 990個原始讀長。文庫的GC含量分別為48.33%和49.67%。將清潔讀長中的有效讀長映射到ovis aries v4.0參考基因組，超過73.5%的讀長被映射到基因組。映射到參考序列多個位置的序列數目低于4.5%，超過70%的讀長被唯一映射到參考序列。大約35%的讀長映射到基因組的正、負鏈。此外，通過注釋分析映射到外顯子區域（約60%）的讀長數量高于基因間和內含子區域。這些結果表明，匹配效率很高，大多數讀長映射到外顯子區域。

2.3 綿羊脾臟中轉錄本的鑒定

在繪制參考序列后，我們從42 460個匯編的轉錄物中鑒定出已知的1 988個lncRNA和38 843個mRNA。lncRNA長度主要分布于200—5 000 bp，平均長度為2 124 bp。此外，lncRNA主要為intergenic lncRNA（字符為u），intronic lncRNA（字符為i），包含2—3個外顯子（圖3）。

2.4 分析和驗證差異轉錄本

利用FPKM值估計lncRNA和mRNA轉錄物的表達水平，其中lncRNA轉錄本表達水平相對較低（圖4）。

在＜0.05和| log2（倍數變化）|＞1的條件下，篩選出14個上調和20個下調的DE lncRNA，370個上調和333個下調的DE mRNA（圖5）。

為了進一步驗證RNA-seq的可靠性，隨機選擇一共12個DE lncRNA和DE mRNA，用q-PCR驗證它們在非腹瀉組和腹瀉組羔羊體內的相對表達水平，發現與RNA-seq結果一致（圖6），表明RNA-seq數據是可靠的。這些分析還表明，高通量測序具有檢測低表達水平（0＜FPKM＜1）基因的優點。

圖3 lncRNA長度、類型、預測lncRNA的外顯子數目統計

圖4 lncRNA（左）和mRNA（右）轉錄本表達水平箱線圖

圖5 非腹瀉組和腹瀉組型羔羊之間差異表達的lncRNAs（左）和mRNAs（右）

圖6 DE lncRNA和mRNA在非腹瀉組和腹瀉組羔羊體內的相對表達水平

2.5 DE lncRNA的GO功能注釋和KEGG 通路富集分析

在“lncRNA名稱--功能預測Term”之間的對應關系中（附件），分別選取預測可信度（按p-value排序）最高的Top 500個預測關系，對其中各個功能預測Term進行頻次計數，統計功能注釋較多的GO（或通路）term，反映該試驗中得到的差異lncRNAs功能分布的整體情況（圖7）。

DE lncRNA與GO 數據庫進行比對的結果表明，一共有34條lncRNA被注釋和分類到302個功能亞類中。圖7顯示了DE lncRNA數量排名前30 位的功能亞類。結果顯示，綿羊蛋白質結合（GO：0005515）、細胞核（GO：0005634）、poly（A）RNA結合（GO：0044822）、細胞質（GO：0005737）、組織重塑（GO：0048771）、內肽酶活性的調節（GO：0052548））、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶復合物（GO：0043540）、磷脂酰肌醇磷酸化（GO：0046854）、果糖-2,6-二磷酸2-磷酸酶活性（GO：0004331）、鈣依賴性磷脂酶C活性（GO：0050429）等10 個功能亞類的lncRNA較多，而其余的功能亞類的lncRNA分布較少。

DE lncRNA與KEGG 通路數據庫進行比對的結果表明，一共有34條lncRNA被注釋和歸類到149個KEGG 通路中。圖7顯示了DE lncRNA數量排名前30 位的KEGG 通路。結果顯示，綿羊甲狀腺激素信號通路（路徑：ko04919）、Spliceosome（路徑：ko03040）、白細胞跨內皮遷移（路徑：ko04670）、神經營養因子信號通路（路徑：ko04722）、溶酶體（路徑：ko04142）、MAPK信號通路-途徑（路徑：ko04011）、鞘脂信號通路（路徑：ko04071）、吞噬體（路徑：ko04145）、氧化磷酸化（路徑：ko00190）等9 個KEGG 通路的lncRNA較多，而其余的KEGG 通路的lncRNA分布較少。

2.6 LncRNAs與其臨近編碼基因的基因組共表達結果

對于感興趣的DE lncRNAs，筆者搜索其上下游100 kb范圍內的所有編碼基因，并與該lncRNA有顯著共表達（皮爾森相關性計算）的基因取交集。這些在基因組上臨近且表達模式上存在共表達的基因很可能被該lncRNA所調控。因此，發現6個基因可能被該相關lncRNA所調控（表5）。

表5 差異lncRNAs的cis調控

3 討論

由于轉錄組分析的快速發展，lncRNAs在過去幾年作為細胞發育中的新型調節劑受到廣泛關注[21]。目前已經鑒定的lncRNAs主要與癌癥相關，如前列腺癌[22]、胃癌[23]、肺癌[24]以及乳腺癌[25]等，以及與生殖功能相關的lncRNA[26-29]。然而，迄今為止，關于羔羊腹瀉的lncRNA，特別是綿羊的研究報道很少。湖羊是一種具有高繁殖力和對濕熱氣候適應性較強的中國特有品種，可以全年在室內飼養。在這項研究中，不僅提供了綿羊腹瀉過程中lncRNA的第一個概況，還研究了lncRNA在抗病過程中的可能作用。

長期以來，羔羊腹瀉對牧場造成了嚴重的經濟損失。在研究中，發現lncRNA的表達水平低于mRNA，與綿羊睪丸組織一致[30]，并且lncRNAs和mRNAs的平均長度比豬更長（分別為1 713和1 983 bp[27]。搜索其上下游100 kb范圍內的所有編碼基因，并與該lncRNAs有顯著共表達（皮爾森相關性計算）的基因取交集，發現6個與lncRNA共表達的基因：MYO1G（肌球蛋白IG）、TIMM29（線粒體內膜的轉位酶29）、CARM1（共激活因子相關的精氨酸甲基轉移酶1）、ADGRB1（黏附G蛋白偶聯受體B1）、SEPT4（septin 4）、DESI2（脫嘌呤的肽酶2）。

MYO1G在維持B細胞淋巴細胞的細胞剛度（cell stiffness）方面扮演了很重要的角色，MYO1G的缺失降低細胞剛度，影響細胞黏附，擴散，吞噬作用和B細胞淋巴細胞的內吞過程[31]。關于TIMM29的研究報道比較少，最近研究報道TIMM29被鑒定為哺乳動物TIMM22蛋白復合物第一個特異性組分，同時其在TIMM23蛋白的組裝過程中扮演重要角色[32-33]。CARM1，是蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族（protein arginine methyltransferase，PRMTs）的成員之一，含 有高度保守結構域的具有甲基轉移酶活性的酶。CARM1 敲除的小鼠出生時就死亡[34]，這表明CARM1為產后生存所必須。后來研究還發現，CARM1抑制能夠促進HIV-1活化[35]。ADGRB1屬于跨膜蛋白家族——黏附G蛋白偶聯受體（aGPCRs）的成員之一，aGPCR家族的定義特征是保守的GAIN結構域，具有自體蛋白水解活性并且可以切割第一跨膜結構域附近的受體，研究發現通過GAIN結構域切割顯示的新的N末端莖可以直接激活作為束縛激動劑的ADGRB1[36]。Septins是一個具有GTP 酶活性的高度保守的細胞骨架蛋白家族，腫瘤抑制因子SEPT4是Septins 家族成員之一，其可誘導癌細胞凋亡[37]。研究發現，SEPT4 基因突變的小鼠精子環及其鄰近的皮質結構紊亂，引起精子活力低下甚至不運動，最終導致不育癥的發生[38-39]。DESI2 基因是一種促凋亡基因，體外試驗表明DESI2基因過表達可誘導胰腺癌等腫瘤細胞凋亡，能有效抑制部分癌細胞增殖，其與IP10的組合基因治療能顯著抑制腫瘤生長，并有效延長了患腫瘤小鼠的存活時間[40-41]。

總共703個mRNA和34個已知的lncRNA在非腹瀉組和腹瀉組之間顯著差異表達，其中14個上調和20個下調DE lncRNA。另外，確定了兩組中共有1 942個新的lncRNA。搜索lncRNA上下游100 kb范圍內的所有編碼基因，并與該lncRNA有顯著共表達（皮爾森相關性計算）的基因取交集，發現6個基因可能被該相關lncRNA所調控。為了進一步驗證RNA-Seq結果，采用q-PCR驗證12種已知的lncRNA和mRNA的表達水平，結果一致。

GO是一種廣泛用于研究基因功能關系的生物信息學工具。對34個DE lncRNA進行GO分析，在Top 500的預測關系對中，有16個DE lncRNA富集到蛋白結合（GO:0005515）條目。KEGG 通路分析表明，信號通路如Sphingolipid signaling 通路（path:ko04071）、Axon guidance（path:ko04360）、Glycosylphosphatidylinositol （GPI）- anchor biosynthesis（path:ko00563）可能是DE lncRNA共表達基因的重要KEGG途徑，相關的lncRNA可能潛在地參與菌毛黏附腸道黏膜的過程。然而，這些通路在抗病過程中的作用很大程度上仍然是未知的。

4 結論

研究了對于腹瀉產生非腹瀉型和腹瀉型羔羊脾臟中lncRNA的表達譜，以進一步了解其在綿羊抗病發生過程中的調控作用。發現了非腹瀉組和腹瀉組羔羊脾臟組織中差異表達的lncRNA。有助于找出羔羊如何抵抗腹瀉的發生機制。此外，進一步研究這些lncRNA可以為羔羊抵抗腹瀉提供科學的依據。

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Changes of LncRNA Expression Profile in Spleen of Diarrhea and Non-diarrhea Individuals in F17 of Hu Sheep Lamb

HUANG SaiNan1, JIN ChengYan1, BAO JianJun2,WANG Yue1, CHEN WeiHao1, WU TianYi1, WANG LiHong1, Lü XiaoYang1, GAO Wen1, WANG BuZhong3, ZHU GuoQiang4, DAI GuoJun1, SUN Wei1,5

(1College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu;2Nanjing New Kyushu Agriculture and Animal Husbandry Technology Co., Ltd., Nanjing 210000;3Jiangsu Source Ecological Agriculture Co., Ltd., Taizhou 225300, Jiangsu;4College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu;5Joint Laboratory of International Cooperation in Agriculture and Agricultural Products Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu)

【Objective】The objective of this study was to investigate the effect of lncRNA on anti-diarrhea in sheep by screening lncRNA differentially expressed inF17 fimbriae non-diarrhea and diarrhea sheep spleen. 【Method】 In this study, individuals with non-diarrhea and diarrhea were obtained by oral administration ofF17 strain to Lake Lamb. The success of the challenge was verified by using intestinal counts and pathological sections of the lambs. A cDNA library of spleen from lambs in non-diarrhea group and diarrhea group was constructed and sequenced by using Illumina HiSeq 2500 platform. Functional description and cell pathway analysis of differentially expressed transcripts were performed by Gene Ontology (GO) and KEGG Pathway enrichment analysis by using FPKM method. The expression levels of lncRNA and mRNA transcripts were screened by high-throughput sequencing technology RNA-seq for differential expression of lncRNA in spleens of non-diarrhea and diarrhea individuals; then, Quantitative PCR was used to detect spleen tissues in non-diarrhea and diarrhea lambs. The expression levels of differentially expressed (DE) lncRNA and DE mRNA were used to verify the role of screened DE lncRNA in the non-diarrhea group. 【Result】 After oral administration ofF17 strain, there were two phenotypes of non-diarrhea and diarrhea. The number of bacteria in the intestine of the diarrhea group was significantly higher than that in the non-diarrhea group (＜0.05), and the jejunal mucosa of the diarrhea group appeared different degrees of damage, dull color, part of the small intestine villi off. We used RNA-seq to screen 34 DE lncRNAs and 703 DE mRNAs in non-diarrhea and diarrhea lamb spleens. A total of 12 DE lncRNA and DE mRNA were randomly selected and verified by q-PCR. Relative expression levels in the diarrhea and non-diarrhea lambs were found to be consistent with RNA-seq results. The comparison between DE lncRNA and GO database by GO and KEGG pathway enrichment analysis indicated that a total of 34 lncRNAs were annotated and classified into 302 functional subclasses. There were more than one functional subclass of lncRNA, such as sheep protein binding (GO: 0005515), nuclear (GO: 0005634), poly (A) RNA binding (GO: 0044822), cytoplasm (GO: 0005737), tissue remodeling (GO: 0048771), regulation of endopeptidase activity (GO: 0052548) ), 6-phosphate fructose-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase complex (GO: 0043540), phosphatidylinositol phosphorylation (GO: 0848654), fructose-2, 6.2-phosphite 2-phosphatase activity (GO: 0004331) and calcium-dependent phospholipase C activity (GO: 0050429), while the remaining functional subclasses had less lncRNA distribution. The alignment of DE lncRNA with the KEGG pathway database indicated that a total of 34 lncRNAs were annotated and classified into 149 KEGG pathways, the sheep thyroid hormone signaling pathway (path: ko04919), Spliceosome (path: ko03040), white blood cell cross Endothelial migration (path: ko04670), neurotrophin signaling pathway (path: ko04722), lysosome (path: ko04142), MAPK signaling pathway-pathway (path: ko04011), sphingolipid signaling pathway (path: ko04071), phagocytosis the body (path: ko04145), oxidative phosphorylation (path: ko00190) and other 9 KEGG pathways had more lncRNAs, while the remaining KEGG pathways had less lncRNA distribution. Through lncRNA-mRNA interaction network analysis, we found six co-expressed genes: MYO1G, TIMM29, CARM1, ADGRB1, SEPT4, and DESI2. 【Conclusion】 This study explored the expression profile of lncRNA in the spleen of non-diarrhea and diarrhea lambs for diarrhea. It was found that lncRNA differentially expressed in the spleen of non-diarrhea and diarrhea lambs, which helped to find out how lambs resist diarrhea and provided a scientific basis for lambs to resist diarrhea.

F17; lncRNA; Lake lamb

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.015

2018-09-18；

2018-12-03

國家自然科學基金（31872333）、科技部家養動物平臺項目、江蘇省重點研發計劃（現代農業）項目（BE2018354）、江蘇省農業重大新品種創制項目（PZCZ201739）、江蘇省農業科技自主創新項目（CX（18）2003）、江蘇高校優勢學科建設工程資助項目、江蘇省高校自然科學研究重大項目（17KJA230001）、江蘇省六大高峰人才項目和揚州大學研究生創新工程項目（XKYCX17_060、SJCX18_0804）

黃賽男，E-mail：1481258911@qq.com。金澄艷，E-mail：1342315339@qq.com。黃賽男和金澄艷為同等貢獻作者。通信作者孫偉，E-mail：dkxmsunwei@163.com

（責任編輯 林鑒非）