褐飛虱GSK-3調控糖原與海藻糖代謝的潛在功能

丁艷娟，劉永康，羅雨嘉，鄧穎梅，徐紅星，唐斌，徐彩娣,3

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褐飛虱GSK-3調控糖原與海藻糖代謝的潛在功能

丁艷娟1，劉永康1，羅雨嘉1，鄧穎梅1，徐紅星2，唐斌1，徐彩娣1,3

（1杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州 310036；2浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，杭州 310021；3杭州師范大學教育學院，杭州 310036）

【目的】昆蟲胰島素信號途徑能夠介導糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，簡稱GSK-3或GSK3）調控體內糖原及海藻糖等糖代謝過程，從而控制昆蟲的各項生命活動。論文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飛虱（）體內對糖原與海藻糖代謝的調控作用。【方法】首先，基于GSK-3的cDNA編碼序列，利用ExPASy工具翻譯GSK-3氨基酸序列，預測蛋白分子量大小及等電點（pI）；然后利用SignaIP4.1Server對其信號肽進行分析。其次，以筆者實驗室飼養的褐飛虱為研究對象，從4齡開始，每12 h取材，取至成蟲48 h。利用Trizol法提取褐飛虱總RNA，根據反轉錄試劑盒合成第一鏈DNA，以18S作為內參基因，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測褐飛虱在不同齡期mRNA水平上的相對表達量。然后利用RNAi技術，向褐飛虱體內顯微注射雙鏈RNA(dsRNA)抑制，以注射ds的褐飛虱作為對照組。注射后48 h利用qRT-PCR技術檢測的表達情況，確定抑制效果。另外，取注射后48 h蟲體，分別測定褐飛虱體內海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase，TRE）活性變化。最后采用qRT-PCR檢測胰島素信號通路胰島素受體基因(insulin receptor，)、類胰島素多肽基因(insulin-like peptides，)及海藻糖代謝途徑、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase，)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase，)、糖原合成酶基因(glycogen synthase，)中相關基因的表達，分析在胰島素信號通路及海藻糖代謝途徑中的調控作用。【結果】褐飛虱開放閱讀框為1 914 bp，編碼637個氨基酸；預測蛋白分子量為69.25 kD，等電點為9.15，為偏堿性蛋白，無信號肽結構，序列高度保守。發育表達模式結果顯示在不同發育階段表達不一致，5齡若蟲蛻皮前后低表達。的dsRNA注射后48 h，與對照組ds相比，表達極顯著下降，表明RNA干擾效果明顯。糖原含量和兩類海藻糖酶活性顯著下降，而海藻糖含量顯著上升，推測糖原和葡萄糖轉化為海藻糖，作為其生理活動的能量來源。qRT-PCR檢測發現，當表達抑制后48 h，的表達量顯著下降，而和的表達量極顯著下降。另外，2個基因、以及的表達量均極顯著下降；胰島素信號通路的2個基因和4個基因的表達同樣被抑制，間接表明能夠調控的表達。【結論】褐飛虱低表達后能夠通過調控胰島素信號通路及海藻糖代謝途徑相關基因表達來調控糖原及海藻糖代謝。相關研究結果有助于更加全面地探索褐飛虱等昆蟲糖原合成酶激酶調控海藻糖及糖類物質平衡的潛在分子機理。

褐飛虱；RNA干擾；糖原合成酶激酶3；糖原與海藻糖代謝；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

0 引言

【研究意義】我國是水稻（）種植大國，自1991年起，稻谷播種面積穩定在3 000萬公頃左右，產量近年來基本維持在2.1億噸。作為重要的糧食作物，水稻產量的穩定對我國民生具有非常重要的意義。但水稻在其生產以及儲存過程經常遭到各種害蟲的威脅。據報道，目前水稻害蟲總數已經超過800種[1]。其中，褐飛虱（）是危害最為嚴重的一種水稻害蟲。褐飛虱是單食性害蟲，具有繁殖速度快、內稟增長率較高、生命周期很短、適應性強等特點[2-5]。另外，褐飛虱具有遷飛性，每年都會從東南亞遷飛到我國危害水稻生產，造成較廣的危害范圍，防治難度大[6]。因此，亟需尋找一種環保、高效的褐飛虱防治方法。【前人研究進展】海藻糖（trehalose）是一種普遍存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、酵母、昆蟲及其他無脊椎動物中的非還原性雙糖[7-8]，也是昆蟲血淋巴中的重要能量物質，為昆蟲進行一系列生命活動提供能源，并調控昆蟲的生長、發育、蛻皮變態等過程，因此被稱為昆蟲的“血糖”[9]。昆蟲體內的糖原以及海藻糖代謝直接影響到昆蟲的一系列生命活動，在這個過程中，糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，簡稱GSK-3或GSK3）起到了至關重要的調控作用[10-11]。相關研究表明，在動物體內，糖原合成酶的主要功能便是在糖原合成的最后一步中催化尿苷二磷酸葡萄糖上的葡萄糖基C1在糖原的非還原性末端C4形成-1,4-糖苷鏈，使原來的糖原分子增加一個葡萄糖單位。GSK-3可以通過使糖原合成酶磷酸化從而使糖原合成酶失活，抑制糖原合成最后一步的進行，并且還可以阻礙胰島素信號通路的傳導從而抑制糖原合成[12-15]。而糖原和海藻糖之間的轉化密不可分，因此的表達對糖原和海藻糖的合成代謝具有重要的影響。GSK-3通過使糖原合成酶磷酸化以及影響胰島素信號通路從而抑制糖原的合成，而糖原與其他的糖類物質之間存在緊密的聯系，它們可以通過酶的催化作用從而互轉化。當昆蟲體內表達失常，其體內糖代謝過程便會失衡，從而昆蟲的發育、蛻皮等一系列生命活動都會出現異常[10,16-20]。目前對GSK-3的調控作用也有一定的研究進展，比如Akt1可以通過調節GSK-3活性來保證黑腹果蠅（）的雌性生殖系干細胞（germline stem cell）的維持[21]。【本研究切入點】前期研究表明GSK3在各種信號傳導途徑中發揮著重要的作用，例如對果蠅的WNK神經起正調節作用[22]。但關于GSK-3與褐飛虱糖類物質代謝關系的研究鮮見報道，GSK-3在褐飛虱胰島素信號通路中的作用也有待研究。【擬解決的關鍵問題】以重要的農業害蟲褐飛虱的為對象，研究其分子特性、時期表達特征，并探究褐飛虱體內GSK-3調控昆蟲主要糖類物質代謝的功能，為將來通過調控昆蟲“血糖”平衡或能量供應來控制害蟲提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017—2018年在杭州師范大學完成。

1.1 供試昆蟲及材料

褐飛虱采自中國水稻研究所，在本實驗室飼養。水稻品種全部采用感蟲水稻TN1（Taichung Native 1）。水稻種植步驟：首先將水稻種子浸入約70℃的溫水中浸泡10 min左右，打破休眠；再將種子浸泡到自來水中放至于30℃人工氣候培養箱泡種24 h；隨后倒去泡種的水，自來水沖洗數次后用濕紗布包裹種子，置于30℃人工氣候培養箱催芽24—48 h，種子發芽后播種于塑料盆；適當施肥促進小苗生長，待長至10 cm左右后，轉移至大田插秧；待水稻生長至分蘗中期后將其移至養蟲籠，每隔2—3 d更換一次水稻。褐飛虱飼養條件：溫度（26±1）℃，光周期16 h/8 h，相對濕度為70%。從4齡若蟲至發育為成蟲后3 d的褐飛虱蟲體，每12 h取材，用于發育表達模式研究。用于后期注射試驗的材料均取5齡若蟲后的褐飛虱。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒（購自Lifetech Scientific Corporation）；pMD18-T、AMV反轉錄試劑盒、6×Loading buffer、DNA Marker DL2000及實時熒光定量PCR試劑（購自大連TaKaRa公司）；PCR引物(上海英濰捷基有限公司合成)；T7 RiboMax Express RNAiSystem（Promega，Madison，USA）；氯仿、異丙醇、EDTA等常規試劑（國藥集團化學試劑有限公司）；實時熒光定量PCR96孔透明板和光學粘性封膜等耗材（Bio-RAD，USA）。

1.3 試驗方法

1.3.1cDNA序列分析 根據褐飛虱轉錄組中獲得的cDNA編碼序列，克隆測序后，利用NCBI中的ORF Finder（Open Reading Frame Finder）（http://cms.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/）工具找到GSK-3的全長ORF序列，并用ExPASy網站translate tool翻譯成氨基酸序列（https://web.expasy.org/ translate/），預測蛋白分子量大小及等電點（pI）；利用SignaIP4.1Server對其氨基酸序列進行信號肽分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）。

1.3.2 總RNA抽提及cDNA合成 利用Trizol試劑盒并按照說明書提取褐飛虱蟲體的總RNA。提取后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，然后利用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA的濃度及純度。使用Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒配置體系并合成cDNA第一鏈。

1.3.3 dsRNA的合成 根據dsRNA特異性片段設計并合成特異性引物，進行PCR擴增，擴增產物再進行T克隆，隨后用帶T7啟動子的引物進行交叉PCR反應，相關引物序列見表1。根據T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒的說明進行ds的合成，隨后采用NanoDropTM2000分光光度計測定ds的濃度，采用同樣的方法合成的dsRNA作為對照組[11]。

1.3.4 褐飛虱的顯微注射 用于顯微注射的材料分為ds以及作為對照的ds。在注射前向標準毛細管注射dsRNA確定顯微注射器每次泵出dsRNA的體積，然后通過調整氮氣壓來調整泵出dsRNA的體積，使其泵出體積符合注射所需量。將用CO2麻醉后的5齡褐飛虱蟲體腹部朝上放置于有瓊脂膠板的一次性培養皿中，注射部位為第一對足中間偏下較軟部位。取5齡第1天的褐飛虱用于顯微注射，注射量均為200 ng/頭，每個處理組注射100頭褐飛虱。注射后48 h取材，用于海藻糖、葡萄糖、糖原含量和海藻糖酶活性測定，以及相關基因表達量測定。

1.3.5發育表達模式及RNAi后海藻糖通路、胰島素信號通路相關基因表達量測定 從4齡若蟲至發育為成蟲后3 d的褐飛虱蟲體，每12 h取材，用于發育表達模式研究；取注射后48 h褐飛虱用于檢測海藻糖通路及胰島素信號通路關鍵基因表達量。采取平行取樣，即每個處理組取3管，每管5頭褐飛虱，最后每個樣品得到3管平行cDNA，放置于-80℃冰箱保存。試驗時，再進行重復點樣，即每管cDNA做3個定量，3管平行cDNA 共得到9個數據，每個樣品為平均值±標準誤，保證數據的可靠性。qRT-PCR反應體系（20 μl）：10 μL SYBR Premix Ex Taq；1 μl上游/下游引物；1 μl cDNA；7 μl滅菌超純水。定量引物見表1。反應程序：95℃預變性10 s，95℃解鏈5 s，59℃退火并延伸30 s，40個循環。

1.3.6 海藻糖、葡萄糖、總糖原含量以及海藻糖酶活性測定 取每個處理及對照組材料，加入100 μl PBS，研磨，再加100 μl PBS，超聲破碎至無塊狀組織，破碎后加入800 μl PBS，4℃，1 000×離心20 min。取350 μl上清，4℃，20 800×超離心60 min。超離心后的上清用于葡萄糖、可溶性海藻糖酶（TRE1）和蛋白質（Pr1）的測定，沉淀用PBS懸浮后用于葡萄糖、膜結合海藻糖酶（TRE2）和蛋白質（Pr2）的測定，具體步驟按照試劑盒說明操作。

1.3.7 數據分析 取3個重復孔的平均CT值用于計算，即最后得到的數據為平均值±標準誤。再帶入2-ΔΔCT公式計算，對照組為褐飛虱注射ds組的CT值。2-ΔΔCT計算公式：

2-ΔΔCT= 2-[(CT實驗組-CT實驗18S)- (CT對照組-CT對照18S)]

應用Excel軟件繪制圖表，并使用STATISTICA 8.0和SigmaPlot 10.0進行統計分析，采用One-Way ANOVA法進行差異顯著性檢驗（＜0.05為差異顯著，用*表示；＜0.01為差異極顯著，用**表示）。

2 結果

2.1 GSK-3的序列結構特征

根據褐飛虱轉錄組數據及克隆驗證后，發現褐飛虱cDNA開放閱讀框全長1 914 bp，編碼637個氨基酸，預測蛋白分子量為69.25 kD，等電點為9.15，為偏堿性蛋白，無信號肽結構（圖1）。GSK-3蛋白含有20種氨基酸，其中絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）和天冬酰胺（Asn）等含量較豐富，所占比例分別為11.1%、8.0%、7.7%和7.5%。酸性氨基酸（帶負電荷）為46個，堿性氨基酸（帶正電荷）為78個。

圖1 褐飛虱GSK-3的核苷酸和氨基酸序列

2.2 褐飛虱GSK-3發育表達模式

褐飛虱在不同發育階段的表達量不同，在4齡初期和末期、5齡48 h和成蟲36 h表達量相對較高；在4齡24 h、5齡的初期及末期表達量相對較低（圖2）。

2.3 RNAi后GSK-3的表達

體外合成的dsRNA注射到褐飛虱體內后，與注射ds組相比較注射后48 h其mRNA表達水平極顯著下降（圖3），該結果表明RNAi有效抑制了的表達。

GSK-3在褐飛虱4齡（第1—4天）、 5齡（第1—7天）和成蟲早期（第1—4天）不同發育天數的表達The relative expression of GSK-3 in different days of 4th instar nymphs (day 1 to day 4), 5th instar nymphs (day 1 to day 7), and early stages of adult (day 1 to day 4)

圖3 RNAi后GSK-3的表達情況

2.4 GSK-3 RNAi后對糖原及葡萄糖含量的影響

與注射ds組相比較，的dsRNA 注射后48 h時糖原含量極顯著下降（＜0.01，圖4-A），葡萄糖含量下降，但無顯著差異（＞0.05，圖4-B）。

2.5 GSK-3 RNAi后對褐飛虱海藻糖代謝的影響

RNAi抑制表達后48 h，海藻糖含量及海藻糖酶活性檢測結果顯示，與注射ds的對照組相比，抑制后48 h褐飛虱海藻糖含量顯著上升（＜0.05，圖5-A），可溶性和膜結合型兩類海藻糖酶活性均顯著下降（＜0.05，圖5-B、5-C）。

圖4 GSK-3 RNAi后對糖原及葡萄糖含量的影響

圖5 GSK-3 RNAi后對褐飛虱海藻糖代謝的影響

2.6 GSK-3 RNAi后褐飛虱海藻糖代謝通路及胰島素信號通路中相關基因的表達變化

采用RNAi抑制褐飛虱的表達后，與注射ds相比較，qRT-PCR檢測結果顯示褐飛虱胰島素信號通路及海藻糖代謝通路相關基因中的、、、、、表達量均顯著或極顯著下降（圖6）。

圖6 GSK-3 RNAi后褐飛虱海藻糖代謝通路及胰島素信號通路相關基因的相對表達水平

3 討論

昆蟲中GSK-3主要作為糖原合成的一個重要限速酶，其序列相對比較保守[23]。本研究通過對GSK-3序列的結構特征進行分析，發現GSK-3為偏堿性蛋白，無信號肽結構，序列高度保守。前期研究發現褐飛虱海藻糖代謝途徑中的和表達被抑制后，糖原的合成也同時受到影響，多表現為糖原含量下降[24]，并且能夠直接影響昆蟲幾丁質合成與蛻皮[25]。并且當糖原合成酶（GS）和糖原磷酸化酶（GP）表達受到抑制后，能夠介導海藻糖代謝調控幾丁質合成途徑（待發表）。相關研究結果顯示，家蠶幼蟲在取食期GSK-3mRNA表達量相對較高，在蛻皮期表達量較低，在幼蟲游走期表達量最低[23]。而且，褐飛虱蛻皮激素響應相關基因與其齡期表達模式有密切關系，對其蛻皮過程至關重要[26]。本研究中，褐飛虱在5齡初期和末期表達量相對較低。

褐飛虱不僅是一種重要的農業害蟲，隨著其基因組測序的完成[27]，發現其非常適合作為基因功能研究的靶標昆蟲[4-5,15]。RNA干擾是基因功能研究的有效工具，主要是通過顯微注射dsRNA或siRNA抑制基因的表達[4]，該技術已經廣泛用于探索和研究昆蟲的相關基因功能，當昆蟲的關鍵發育基因被抑制后，其影響通常會表現在不同組織的表型上[5,28-31]。本試驗中，褐飛虱dsRNA注射后48 h，該基因的表達與注射ds相比較，表達量極顯著下降，表明RNA干擾效果明顯。在前期研究中發現GSK-3參與胰島素、Wnt/-連環蛋白、Hedgehog以及Notch等信號傳導通路，在調控細胞的分化、代謝、凋亡以及基因表達等方面都起著重要作用[32]。GSK-3主要通過胰島素受體底物-1（IRS-1）的Ser332位點實現對胰島素信號通路的阻礙，從而抑制糖原合成[33]。本研究發現，被抑制后48 h糖原和葡萄糖含量極顯著降低或下降，表明GSK-3能夠調控糖原和葡萄糖的合成。GSK-3還能通過糖原合成酶磷酸化以及影響胰島素信號通路從而抑制糖原的合成，而糖原與其他的糖類物質之間存在緊密的聯系，它們可以通過酶的催化作用從而相互轉化[10]。這一點從本研究中也得到了驗證，當表達被抑制后，糖原和葡萄糖含量降低，轉化為海藻糖而導致含量顯著上升，作為其生理活動的能量來源。上述研究結果表明，GSK-3在多種細胞信號通路中都起到關鍵性的調節作用[28]。

GSK-3廣泛存在于動物體內，主要在動物腦組織中表達，負責信號的傳遞[11,34-36]。在家蠶幼蟲中注射家蠶素II時，其體內海藻糖濃度會降低，且海藻糖酶的活性得到提高；同時還能降低糖原含量和提高糖原酸化酶的活性[37]，但是當家蠶成蟲注射家蠶素時，其血淋巴中的海藻糖或脂質水平卻沒有受到影響[38]。本研究發現，當表達抑制后48 h，及的表達極顯著下降，同時，2種海藻糖酶活性也顯著下降，海藻糖含量上升，表現出一致性。另外，2個的表達也極顯著下降，同時被抑制后48 h能夠極顯著降低或降低糖原、葡萄糖含量，這與前期相關的研究結果一致[39]，說明可以通過調控TRE活性變化和表達來影響3種糖類物質含量。相關研究報道胰島素進入昆蟲體內后，先激活和，再激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K），活化的PI3K催化磷脂酰肌醇的磷酸化，接著引起效應器Akt的磷酸化，并喪失磷酸化糖原合成激酶（GSK-3）活性，抑制其對糖原合成酶（GS）的磷酸化作用，促使GS變為有活性的分子，從而促進糖原的合成[15]。從本試驗來看，表達抑制后，降低了及的表達量，從而影響糖原及其他糖類物質的合成，即表達抑制后能夠下調胰島素通路中的相關基因，從而調控海藻糖等糖類物質代謝。而抑制后，葡萄糖含量變化不顯著，推測是因為褐飛虱體內還存在其他糖代謝途徑，例如胰島素信號通路的其他基因對褐飛虱糖代謝的調控等。對于胰島素途徑中的和，當的表達被抑制后，2個和4個的表達同樣被抑制，間接表明能夠調控的表達，其具體機制有待于進一步研究。

4 結論

RNA干擾后可以有效抑制褐飛虱體內靶標基因的表達；GSK-3能夠降低海藻糖和糖原代謝相關基因的表達及海藻糖酶活性，從而降低糖原和葡萄糖含量，提高海藻糖含量，并調控昆蟲海藻糖平衡。

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Potential functions ofGSK-3 in Regulating glycogen and trehalose metabolism

DING YanJuan1, LIU YongKang1, LUO YuJia1, DENG YingMei1, XU HongXing2, TANG Bin1, XU CaiDi1,3

(1College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036;2Institute of Plant Protection and Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021;3College of Education, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

【Objective】The insect insulin signaling pathway can mediate glycogen synthase kinase 3 (GSK-3 or GSK3) to regulate glucose metabolism in the body, such as glycogen and trehalose, thereby controlling different life activities of insects. The objective of this study is to explore the regulation of glycogen synthase kinase on the metabolism of glycogen and trehalose in.【Method】 Firstly, based on the cDNA coding sequence of GSK-3, the GSK-3 amino acid sequence was translated using the ExPASy tool to predict the molecular weight and isoelectric point (pI) of the protein, and then the signal peptide was analyzed by SignalaIP4.1Server. Secondly, theraised in the author’s laboratory was collected every 12 hours from the 4th instar to 48-h-old adult. The total RNA ofwas extracted by Trizol method. The first strand DNA was synthesized according to the reverse transcription kit, and 18S was used as the internal reference gene. The relative expression ofdifferent ages at mRNA level was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Then, double-stranded RNA (dsRNA) was microinjected intowith RNAi technology to inhibit the, andof dswas injected as a control group. The expression ofwas detected by qRT-PCR 48 h after injection to determine the inhibitory effect. In addition, thewas taken 48 h after injection, and the change of trehalose, glucose, glycogen content and trehalase (TRE) activity inwas determined. Finally, the relative expression of related genes in insulin signaling pathway (including insulin receptor (), insulin-like peptides ()) and trehalose metabolism pathway (, trehalose-6-phophate synthase (), glycogen phosphorylase (), glycogen synthase ()) was detected by qRT-PCR to analyze the regulation of【Result】The open reading frame ofis 1 914 bp, encoding 637 amino acids; the predicted molecular weight of the protein is 69.25 kD, and the isoelectric point is 9.15. It is a basic protein with no signal peptide structure and the sequence is highly conserved. The results of developmental expression pattern showed that the expression ofwas inconsistent at different developmental stages, and the expression was low before and aftermolting of5th instar nymph.At 48 h after the dsRNA injection of, the expression ofdecreased significantly compared with the dsof the control group, indicating that the RNA interference effect was obvious. Glycogen content and two types of trehalase activity decreased significantly, while trehalose content increased significantly. It is speculated that glycogen and glucose are converted to trehalose as an energy source for their physiological activities.The results of qRT-PCR showed that the expression ofsignificantly decreased 48 h after the inhibition ofexpression, while the expression ofandextremely significant decreased. In addition, the expression of twogenes,andgenes all extremely significant decreased; the expression of twogenes and fourgenes in the insulin signaling pathway were also inhibited, indirectly indicating thatcan regulate the expression of. 【Conclusion】 The low expression ofcan regulate glycogen and trehalose metabolism by regulating insulin signaling pathway and trehalose metabolism pathway related gene expression. The relevant research results will help to explore more comprehensive molecular mechanisms for the regulation of the balance of trehalose and carbohydrates by insect glycogen synthase kinases such as.

; RNA interference (RNAi);glycogen synthase kinase 3; glycogen and trehalose metabolism; quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.011

2018-11-15；

2018-12-29

國家自然科學基金（31672081，31371996）、國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201810346031）

丁艷娟，E-mail：dyj061004djy@163.com。通信作者徐彩娣，Tel：0571-28865680；E-mail：xucaidi001@163.com

（責任編輯 岳梅）